Aula completa.

1. Ramon Oliveira Vidal
Email: ramon.vidal@gmail.com
Doutorando em Genética e Biologia Molecular
Sub área: Bioinformática
Orientador: Gonçalo A.G. Pereira
LGE
-
Laboratório
de
Genômica
e
Expressão
@ramonvidal

2.  Marcadores Moleculares
◦ Marcadores por Hibridação
◦ Marcadores por Amplificação
 Polimorfismos X mutações
 SNPs
◦ Origem
◦ Aplicações
◦ Haplótipos
◦ Genotipagem
◦ Identificando os SNPs (em genomas e transcriptomas)
 Sanger
 454
 Solexa
 Taxa de evolução
 Identificação de SNPs em Coffea arabica

3. Fenótipo
Propriedades observáveis de um indivíduo, que se
desenvolveram sob a influência de:
 genótipo do indivíduo
 fatores ambientais
Genótipo
Constituição genética de um organismo
como revelada pela análise genética e
molecular, ou seja, o conjunto completo de
genes, tanto dominantes e recessivos.

4.  Qualquer característica morfológica ou
molecular que diferencia indivíduos, e que
seja facilmente detectável

5. É um fenótipo de fácil identificação, normalmente
determinado por um único alelo.
Características fenotípicas de fácil identificação visual
são utilizadas como marcadores morfológicos desde
os tempos de Mendel

6. Polimorfismo detectado na seqüência de DNA
 Vantagens:
- Não é objeto de influências ambientais;
- Praticamente ilimitado em número;
Maior desvantagem é a necessidade de técnicas e
equipamentos mais complexos.

7.  Reprodutibilidade;
 Amplamente distribuído através do
genoma;
 Poder de discriminação;
 Ausência de influências ambientais;
 Barato;
 Fácil de mensurar

8.  Diplóide: Constituído por duas cópias (homólogos)
de cada cromossomo.
 Alelo: As formas alternativas de um caráter
genético encontrado em um determinado locus de
um cromossomo.
 Homozigotos: Um organismo diplóide com alelos
idênticos de um determinado gene em ambos os
cromossomos homólogos.
 Heterozigotos :Um organismo diplóide com alelos
diferentes de um determinado gene em ambos os
cromossomos homólogos.

9. Diplóide
Haplóide
Alelos
homozigoze
heterozigoze

10.  Hibridação
◦ RFLP – (Restriction Fragment Length Polymorphism)
◦ Minissatélites – VNTR –(Variable Number of Tandem
Repeats)
 Amplificação de DNA
◦ RAPD – (Random Amplified Polymorphic DNA)
◦ SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions)
ou ASA (Amplified Specific Amplicon)
◦ Microssatélites –SSR (Simple Sequence Repeats)
◦ AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

11. RFLP– Restriction Fragment Length Polymorphism

12. RFLP– Restriction Fragment Length Polymorphism

13. Polimorfismo de DNA
entre indivíduos pode ser
devido a:
• Ausência do sítio do
primer.
• Surgimento de um novo
sítio.
• Ao comprimento da
região amplificada entre
sítios de primer

14.  Significa Seqüências Simples Repetidas, a
qual consiste de pequenas seqüências de
nucleotídeos (1 a 4) repetidas em tandem.
 Essas seqüências são distribuídas ao acaso
no genoma e é um dos marcadores mais
utilizados atualmente

15.  Primers específicos (20 a 30 pb).
 Diferentes números de elementos simples
repetidos.
 Cada segmento amplificado de tamanho
diferente representa um alelo diferente do
mesmo loco

17.  Mutações genéticas
◦ Alteração na seqüência de nucleotídeos de uma
molécula de DNA.
◦ O termo "mutação“ é geralmente usado para referir-se a
alterações na seqüência de DNA que não estão presentes
na maioria dos indivíduos de uma espécie
 Polimorfismos genéticos
◦ Diferença na seqüência de DNA entre indivíduos, grupos
ou populações.
◦ Incluem SNPs, seqüências repetitivas, inserções,
deleções e recombinações.
 Podem dar origem a olhos ou olhos castanhos, cabelo liso
ou cabelos crespo
◦ Resultado de processos naturais ou induzidos por
agentes externos (como vírus ou radiação).

18.  Polimorfismos são alterações no DNA que se
mantém nas gerações futuras
◦ Polimorfismo: variação >1%
◦ Mutação: variação <1%
C T T A G C T T
C T T A G T T T
Polimorfismo
C T T A G C T T
C T T A G T T T
Mutação
94%
6%
99.9%
0.1%

19. TAAAAAT
TAACAAT
TAAAAAT TAAAAAT TAACAAT TAACAAT TAACAAT
TAAAAAT TAACAAT
TAAAAAT
• Polimorfismos foram
mutações que se propagaram
ao longo de gerações
Polimorfismos genéticos X Mutações
genéticas

20.  Single Nucleotide
Polymorphism, ou SNP
("snip"):
◦ pequena mudança, ou variação,
que pode ocorrer em um único
nucleotídeo numa sequência de
DNA em uma porção significativa
(mais de 1%) de uma população.

21.  SNPs são as mais frequêntes formas de
variações genéticas
◦ 90% das variações genéticas humanas
vêm dos SNPs
 SNPs tem se tornado marcadores de preferência
pela sua grande abundância e pelo
desenvolvimento de tecnologias de
genotipagem em larga escala.

22.  SNPs em menor quantidade em genes do que em regiões não-
codificantes
 Menor quantidade de SNPs nos cromossomos sexuais (humano).
 Dentro de um único cromossomo, SNPs podem se concentrar em
uma região específica, geralmente implicando uma região de
interesse ou de pesquisa.
 Em média, ocorrem a cada 300~600 nucleotídeos (humano).
 Genes com maior pressão para modificação tem maior frequência de
SNP (resistência, adaptação, interação parasita-hospedeiro, etc)

23.  Intra espécie
◦ Diversidade entre os indivíduos de uma
mesma espécie
◦ Reflete os SNPs entre os alelos (espécies
diplóides)
 Inter espécies
◦ Diversidade entre espécies diferentes

24. Não-codificantes Codificantes
Sinônimas Não-sinônimas
conservativas Não-conservativas
Transições
Purina<->Purina
Pirimidina<->Pirimidina
Transversões
Purina<->Pirimidina

25.  Genotipagem
◦ Detecção de genótipos de individuos.
◦ Pode ser realizada observando os SNPs.
 Haplótipo (genótipo haplóide)
◦ Alelo encontrado em um único cromossomo que
apresenta o mesmo padrão de SNPs.
◦ Blocos haplótipos e tendem a ser herdados
juntos.
◦ Podem servir como marcadores de doença
genética.
◦ A análise de haplótipos é útil na identificação de
eventos de recombinação.

26.  Dentro de um bloco haplótipo, acontece pouca
ou nenhuma recombinação
 Os SNPs dentro de um bloco haplótipo são
passados juntos nas gerações futuras

27.  Um haplótipo é um conjunto de SNP no mesmo
cromossomo
SNP1 SNP2 SNP3
-A C T T A G C T T-
-A A T T T G C T C-
-A C T T T G C T C-
Haplotype 2
Haplotype 3
C A T
A T C
C T C
Haplotype 1
SNP1 SNP2 SNP3

28. Recombination
hotspots
Chromosome
Haplotype
blocks
C1 C2 C1
S1
S2
S3
S4
S5
S1
S2
S3
S4
S5
SNP
loci
Haplotype patterns : Major allele
: Minor allele
SNP
loci
C2
I1 I2

29.  SNPs estão relacionados com a diversidade
de genótipos de humanos
◦ podem ser mapeados relacionando-os a
diversidade de fenótipos.
 Um SNP individual ou um bloco haplótipo
pode servir de indicação para
◦ características agronômicas
◦ doenças
◦ etc
 Essa relação constitui a base e a motivação
para a identificação e genotipagem de SNPs.

30.  O genoma de cada indivíduo contém
distintos padrões de SNPs
 Pessoas podem ser agrupadas de acordo
com esse perfil
 Perfil de SNPs são importantes na
identificação de respostas a terapias
◦ Existe uma correlação entre certos perfis de SNPs
e respostas específicas a tratamentos

31.  Genoma/transcriptoma
◦ Sanger
◦ 454
◦ Solexa/Solid/...
 Alinhamento de sequências
 Identificação de Discrepâncias

32. Encontrando SNPs:
Mineração de SNPs baseados no sequenciamento
(Sanger tradicional)
Sequenciamento
De DNA
mRNA
cDNA
Library
EST
Overlap
Genomic
BAC
Library
RRS
Library
BAC
Overlap
Shotgun
Overlap

33. Fragment DNA
DNA from multiple individuals
Sequence and Reassemble
(known sequence) Assembly with other overlapping
GTTACGCCAATACAGGATCCAGGAGATTACC
GTTACGCCAATACAGCATCCAGGAGATTACC
mismatches = SNPs
Encontrando SNPs:
Mineração de SNPs baseados no sequenciamento

34. Base-calling Contig assembly
Sequence viewing
Polymorphism tagging
Relatório de polimorfismos
Genotipagem individual
Polymorphism detection
PolyPhred
Consed
Analysis
Sequenciamento Phred Phrap
Amplificação do DNA
5’ 3’
Vários indivíduos

35. SNP Discovery - Sanger sequencing (EST)

36. SNP Discovery - Diploids (heterozygous loci)

38.  Método Sanger foi o único utilizado por 30
anos
 Sanger processa em paralelo 96 sequencias
enquanto NGS processa milhões de
sequencias a um custo 6X menor.
 Problemas:
◦ Fidelidade dos dados
◦ Tamanho dos reads
◦ Custo da infraestrutura
◦ Manipular grandes volumes de dados

39.  Sequencias curtas não mapeiam unicamente
em um lugar no genoma.
 Solução #1: Reads longos.
 Solução #2: Reads pareados.
ACTTAAGGCTGACTAGC TCGTACCGATATGCTG

42.  Necessário ter uma montagem de referência
 Mapeamento dos reads na referencia
 Coberturas médias necessárias:
◦ Solexa - 100X, 454 - 10X
 Análise estatística para validar discrepâncias com base na
redundância dos dados
 Muitos Softwares disponíveis
 Desenvolvimento de algorítmos para aumentar velocidade de
processamento

43. http://seqanswers.com/wiki/Special:BrowseData

44. sequencing errors SNP

47. AACGTTAGCATA
AACGTTAGCATA
AACGTTAGCATA
strain 1
strain 2
strain 3
haploid
individual 1
individual 3
individual 2
diploid
AACGTTCGCATA
AACGTTCGCATA
AACGTTAGCATA
AACGTTAGCATA
AACGTTAGCATA
AACGTTAGCATA
AACGTTAGCATA
AACGTTCGCATA
AACGTTCGCATA
AACGTTCGCATA
AACGTTCGCATA
AACGTTCGCATA
AACGTTCGCATA
AACGTTAGCATA
AACGTTAGCATA

48. Para inferir uma taxa de evolução a um gene
são estimados o KA e o KS
KA - é a relação entre substituições não
sinônimas e todos os possíveis sitios não
sinônimos
KS – é a relação entre substituições
sinônimas e todos os possíveis sítios
sinônimos

49. Exemplo:
Prolina:
◦ CCT
◦ CCA
◦ CCG
◦ CCC
Um sítio sinônimo e dois não sinônimos

50.  A taxa KA/KS é uma medida clássica da evolução de
maneira global num gene
 KA/KS << 1 indica que uma substancial proporção de
mudanças de aminoácidos devem ter sido eliminadas
por seleção de purificação.
 KA/KS > 1 indica seleção adaptativa ou positiva

51.  NG: Nei, M. and Gojobori, T. (1986) - Faster
 LWL: Li, W.H., et al. (1985)
 LPB: Li, W.H. (1993) and Pamilo, P. and
Bianchi, N.O. (1993)
 MLWL (Modified LWL), MLPB (Modified LPB):
Tzeng, Y.H., et al. (2004)
 YN: Yang, Z. and Nielsen, R. (2000)
 MYN (Modified YN): Zhang, Z., et al. (2006)
 GY: Goldman, N. and Yang, Z. (1994)
 MS (Model Selection), MA (Model Averaging)

52.  A taxa de KAKS em humanos e chimpanzes é de
0,23.
 Assumindo que mutações sinônimas são neutras,
esse resultado implica que 77% das alterações de
aminoácidos em genes hominideos são
suficientemente deletérias e são eliminadas por
seleção natural. Como mutações sinônimas não são
totalmente neutras, a proporção de alterações de
aminoácido neutras com consequências deletérias
deve ser maior

54.  Identificar e caracterizar SNPs em sequências
de EST
 Identificar os haplótipos com base nos
padrões de SNPs
 Identificar kaks
 Foram utilizados dados de duas espécies de
café:
◦ Coffea arabica,
◦ Coffea canephora

55.  Espécie diplóide
 Polinização cruzada: Alógama.
 Alta variabilidade
 C. canephora é melhor adaptada ao clima
equatorial úmido e quente
 Cultivada em baixas e médias altitudes
 Qualidade de bebida inferior
 Mais resistente a diversas condições do que
Coffea arabica, em particular a doenças e
pragas.

56.  Allopoliploide (tetraplóide)
 Autógama
 Baixa variabilidade
 Originada de um cruzamento recente
(1mya) entre Coffea eugenoides e Coffea
canephora
 Espécie mais cultivada. Ocupa 75% das
plantações mundiais de café.
 Qualidade da bebida excelente.

58.  CAP3 para montagem dos EST
 QualitySNP
 KaKs_calculator
 Scripts PERL

59.  95% similaridade por 100bp
◦ Previnir agrupamento de parálogos
 Remover clusters com menos de 4
ESTs
 Remover clusters com mais de 500
ESTs
◦ Evitar contigs mal formados

60.  Analisar informações do CAP3 (Arquivo ACE)
 Detecção de SNPs
◦ Filtros
◦ Reconstrução de haplótipos
 Detecção de polimorfismos sinônimos e não
sinônimos com o FASTY
 Construir Banco de dados com os dados
gerados.

61.  Detecta todos os SNPs bi, tri e tetra alélicos
 Cada alelo é representado com mais de uma
sequencia.
◦ Excluindo SNPs singlets
 Classificação dos SNPs como intra ou inter
espécies

62.  Agrupa sequências que representam um
mesmo alelo
 Tem os mesmos nucleotídeos nos sítios
polimorficos.
 Utiliza métodos matemáticos para minimizar
falsas reconstruções de haplótipos
 Exclui haplótipos formados por apenas uma
sequencia

63.  É calculado de acordo com a ocorrencia do
SNP em cada alelo com relação às regiões de
alta e baixa qualidade
 O score de confiabilidade é o menor valor
 Descartados valores abaixo de 2

66.  Fasty
◦ Produz menores alinhamentos em sequencias de
baixa qualidade
 Detecção da ORF
 Correção de frameshifts
 Detecção de sSNP/nsSNP e SNPs ou INDELs
em regiões UTR
 Kaks Calculator

68.  Identificação dos ancestrais haplótipos
 Padrões diferentes de expressão dos
homeologos
 Contribuição de cada ancestral de arabica no
transcriptoma relacionando ao fenótipo
 Genes com maior pressão seletiva para
mudança
 Genes com maior pressão seletiva para
estabilização
 Artigo submetido e em revisão

69. Genômica, Transcriptômica, Biologia Sintética,
Biologia de Sistemas
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