uso de marcadores moleculares em arroz selvagem

1. UFT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
Apresentação
MESTRANDO: Marcio Akio Ootani
GURUPI -TO
JULHO-2007

2. UTILIZAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES NA DEFERENCIAÇÃO DE
ARROZ SELVAGEM (Oryza glumepatula Steud )

3. Localização do projetoLocalização do projeto
 EMBRAPA Arroz Feijão.EMBRAPA Arroz Feijão.
 Localizada no município de Santo Antonio de Goias – GO.Localizada no município de Santo Antonio de Goias – GO.
 Orientador de estagio: pesquisador Cláudio Brondani.Orientador de estagio: pesquisador Cláudio Brondani.
 Laboratório de biotecnologia sala BIO-2.Laboratório de biotecnologia sala BIO-2.
A r r o z e F e ijã o

4. Conceito de biotecnologia
-Biotecnologia consiste na aplicação em grande escala, ou transferência
para indústria, dos avanços científicos e tecnológicos, resultantes de
pesquisas em ciências biológicas.
-Ou seja, o uso de organismos vivos (ou suas células e moléculas) para
produção racionalizada de substâncias, gerando produtos
comercializáveis.

5. INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO
 Arroz selvagem O.glumepatula ajuda no
aumento da diversidade genética
 Aumento de produção e produtividade em
culturas agrícolas
 Auxílio aos programas de melhoramento de
plantas.
 Introdução de genes em variedades
economicamente importantes
 Preservação e estudos ecológicos (diversidade)
 Desenvolvimento de diverso marcadores para
auxiliar o melhoramento genético.

6. Histórico
 1863 -Mendel, com seus estudos em ervilhas,
descobre que os caracteres são transmissíveis dos pais
para as progênies por meio de unidades
independentes, denominadas mais tarde de genes.
 1970 -Enzimas de restrição (nucleases específicas) são
identificadas, abrindo o caminho para clonagem
molecular de genes.
 1983 -A técnica de PCR (PolymeraseChainReaction),
que usa ciclos de síntese de DNA para produzir
inúmeras cópias de genes ou fragmentos de genes, é
desenvolvida. Mais tarde, se tornou uma das
principais ferramentas nas pesquisas biotecnológicas.

7. Histórico
 1988 -O projeto de seqüenciamento do genoma
humano é aprovado. Implica no mapeamento e
seqüenciamento dos genes humano.
 2000 -Obtenção de arroz modificado geneticamente
que produz beta-caroteno, precursor de Vitamina A na
China.
 2000 -Cientistas do Estado de São Paulo revelam o
código genético completo da bactéria Xylellafastidiosa.
Isto corresponde à primeira bactéria fitopatogênicaa
ter o seu genoma decifrado.
 2001/2002 -Genoma humano/algodão colorido.

8. Impactos sobre a sociedade e o meio
ambiente
 Aumento de produção e produtividade
 Redução dos custos da produção
 Diminuição do uso excessivo de inseticidas/herbicidas
 Preservação e criação de variabilidade genética
 Utilização forense Porém
 É necessário formar consciência crítica
 Necessidade de estudos sobre possíveis problemas desencadeados
 Bioterrorismo

9. Marcadores no melhoramento genéticoMarcadores no melhoramento genético
 Identificação e proteção de variedades e ou clones patenteados;
 Certificação de pureza genética de linhagens e híbridos;
 Construção de coleções nucleares;
 Atribuição de linhagens a grupos heteróticos;
 Seleção e recombinação dirigida de genótipos superiores;
 Cruzamento interespecifico assistido por marcadores;
 Seleção durante o desenvolvimento de linhagens endogamicos;
 Seleção indireta para características de difícil avaliação(resistência a
fatores bióticos e abióticos);
 Monitoramento de fecundação cruzada e autofecundação;
 Utilização na correlação entre a diversidade genética e distancia
geográfica;

10. Marcadores na diferenciação deMarcadores na diferenciação de
organismosorganismos
 Com o conhecimento da base genética da
resistência poderemos desenvolver marcadores
moleculares ligados a resistência para
diferenciar esse organismos
 Obtenção de marcadores moleculares de
organismos tolerantes a condições adversas.
 Diferenciação de insetos resistente a
determinado inseticida e se esta correlacionada
com a distancia geográfica.
 Transgenico (introdução de genes de
organismos).
 Diferenciação de raças de fungos
fitopatogenicos.
 Plantas com maior valor nutricional.

11. Tipos de marcadoresTipos de marcadores
 CONCEITO: Qualquer característica, processo bioquímico ou
fragmento de DNA que permita a distinção de indivíduos
geneticamente diferentes.
APLICAÇÕES DOS MARCADORES MOLECULARES
 -Identificação e discriminação de genótipos.
 -Quantificação da variabilidade genética existente.
 -Mapeamento genético
 -Clonagem de genes.
 -Mais utilizados RFLP, RAPD, AFLP, micro e minisatélites(SSR).

12. RAPDRAPD(polimorfismo de DNA amplificado ao(polimorfismo de DNA amplificado ao
acaso)acaso)
 Originam-se a partir da amplificação por uma enzima DNA
polimerase e ao acaso de seqüências específicas de DNA com
seqüências arbitrárias de nucleotídeos que servem de primers.
 Caracterização e estudos genéticos de plantas e de populações.
 Seleção assistida.
Vantagens e Limitações
- Rápidos;
- Utilizam uma quantidade mínima de DNA;
- Detecção de polimorfismo pela visualização direta de bandas no gel;
- Grande sensibilidade na detecção de polimorfismo;
- Técnica alternativa de clonagem;
- Menor custo;
- Não necessita de radioisótopos;
- Distribuição em todo o genoma;
- Dominante.

13. LimitaçõesLimitações
- baixo conteúdo de informação genética por
loco;
- apenas um alelo é detectado;
- demais variações classificadas conjuntamente
como alelo nulo.

14. Interpretação do padrão de bandas
RAPD
Polimorfismo de DNA entre indivíduos pode ser devido a:
 Ausência do sítio do primer.
 Surgimento de um novo sítio.
 comprimento da região amplificada entre sítios de primer.
Exemplo de um gel de RAPD de qualidade indesejável

15. Exemplo de um gel de RAPD de
excelente qualidade
- Presença de polimorfismo

16. SSR(seqüências simples repetidas)SSR(seqüências simples repetidas)
 Amplificação de SSR através de PCR utilizando-se um par de
“primers” específicos (20 a 30 pb).
 Polimorfismo extensivo resultante da presença de diferentes
números de elementos simples repetidos.
 Cada segmento amplificado de tamanho diferente representa um
alelo diferente do mesmo loco.

17. VANTAGENSVANTAGENS
- Codominante
- Multialélico
- Elevado conteúdo de informação de polimorfismo
- Microssatélites são freqüentes e distribuídos ao acaso (cobertura completa do
genoma).
LIMITAÇÕES
- Requer biblioteca de fragmentos genômico para o
organismo de interesse;
- Grande mão-de-obra;
- Pessoal especializado;
- Equipamentos sofisticados (sequenciador automático).

18. EletroforeseEletroforese
 Separação de diversas moléculas como lipoproteínas, proteínas, RNASeparação de diversas moléculas como lipoproteínas, proteínas, RNA
e e DNA.e e DNA.
 Baseia-se na carga negativa global de uma fitaBaseia-se na carga negativa global de uma fita

19. PrincípioPrincípio

20. Gel de poliacrilamidaGel de poliacrilamida
 Polimeração de acrilamida.
 Visualização por revelação com nitrato de prata.
 Distancia percorrida de acordo com o tamanho molécula.
 Utilização de marcador padrão Ladder (escada)
 Tamanho de moléculas menores

21. Aparelho de gel de poliacrilamidaAparelho de gel de poliacrilamida

22. Gel de agaroseGel de agarose
 Polímero linear extraído de algas marinhas
 Fluorescente com Brometo de etidio.
 Visualização em luz ultra violeta.
 Indicado para fragmentos de DNA ate cerca de 40 – 50 kb
 Velocidade de migração e poder de resolução depende do tamanho e
forma da molecula

23. Aparelhos de gel de agaroseAparelhos de gel de agarose
Cuba de gel de agarose

24. OBJETIVOOBJETIVO
Geral:
-Diversidade genética dos genótipos de duas populações de arroz
selvagem(O. glumepatula) obtidas dos estados de Tocantins e Roraima.
Especifico:
-Utilização dos marcadores moleculares na diferenciação e
distancia gênica e se a correlação geográfica.
-Utilização de diferentes primers para diferenciação dos genótipos das
populações.
-utilização primers para caracterização dos genótipos com lócus gênicos em
heterozigose e homozigose

25. Material e metodosMaterial e metodos
- Realizado na EMBRAPA Arroz e feijão
Santo Antonio de Goias-GO, Área de 1000ha
Obtenção do arroz selvagem
- Obtidas do estado do Tocantins e Roraima.
- Multiplicada em casa de vegetação.
-Coleta de 8 indivíduos de cada, população 1 Tocantins
população 2 Roraima

26. Extração de DNA genômicoExtração de DNA genômico

27. Quantificação do DNAQuantificação do DNA
 Corrida em gel de agarose 1%.
 marcador no DNA fluorescencia de Brometo de etidio.
 Marcador conhecido lambda 10 pb em concentrações de 25, 50, 100,
200 e 400.
 Quantidade 3 micro litro de DNA e 1 micro litro de Lambda.
 Diluição do DNA nas amostra.
 Igualar a quantidades de DNA .
 Reação PCR adição do MIX + primer.
 Amplficação das amostras no termociclador.

28. ResultadosResultados
Quantificação do DNA

29. Teste de amplificaçãoTeste de amplificação
Mostrou que houve amplificação do DNA

30. PCR-SSRPCR-SSR
200
150
100
100 100
250
150
150
100
200
150
100
100 100
250
150
150
100

31. Dendrograma

32. Resultados e discussãoResultados e discussão
-- Segundo a corrida de gel de agarose houve polimorfismo com os pimers OG106,
4653 e RM 38
- Nos primer OG61, RM 335 e RM 257 observou-se homozigose.
- Mas no OG106 apresentou heterozigose nos indivíduos 11, 13 e 14.
- Optou-se pelo gel de poliacrilamida por ser mais sensível por detectar as banda
com mais sensibilidade.
- Gerou-se o dendrograma.
- Coeficiente RW (Wrigth. (1978)

33. CONCLUSÃOCONCLUSÃO
-- A utilização de marcadores moleculares do tipo SSR foi
eficiente na diversificação genética entre os genótipos e
entre populações de arroz selvagem Oryza glumaepatula
obtidas dos Estados de Tocantins e Roraima.
- Os primers utilizados apresentaram bandas polimorficas
significativas permitindo dos estudos filogenéticos entre os
genótipos.
- As bandas amplificadas em gel de agarose apresentaram
menos significativa em polimorfismos do que em gel de
poliacrilamida.
- O estudo de marcadores moleculares pode ser uma ótima
ferramenta na utilização de programas de melhoramentos
genética de arroz, podendo ampliar sua variabilidade
genética, por meio de cruzamento interespecifico.

34. CONSIDERAÇÕES FINAISCONSIDERAÇÕES FINAIS

35. Obrigado pela atenção!!!Obrigado pela atenção!!!