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CLONAGEM
PROFª DRª PRISCILA L. MELLO
ELABORADO POR: PROFª DRª MARTA F. BASTOS
CLONAGEM
• Originada da palavra grega Kólon, que designa forma de reprodução
assexuada, ou seja, geração de indivíduos idênticos ao doador do DNA;
• Ocorre naturalmente em organismos unicelulares e plantas;
• Atualmente o termo clonagem é utilizado mais para a produção de
organismos idênticos derivados de um ancestral comum.
TIPOS DE CLONAGEM
Reprodutiva
- Técnica de transferência nuclear utilizada pela primeira vez
com sucesso em mamíferos na geração da ovelha Dolly em 1997.
- A célula de um indivíduo adulto é
fundida com um óvulo sem núcleo, de
forma que o "embrião" gerado possui
o conteúdo genético da pessoa que
doou a célula.
Clonagem Reprodutiva
Clonagem Reprodutiva
Tipos de Clonagem
 Terapêutica
- Aprimoramento das técnicas hoje existentes para
culturas de tecidos, que são realizadas há décadas.
- É feita a transferência do núcleo de uma célula de
uma pessoa para um óvulo sem núcleo, que ao dividir-se
gera, em laboratório, células potencialmente capazes de
produzir qualquer tecido.
Clonagem Terapêutica
Terapêutica x Reprodutiva
• Clonagem Molecular
- É o processo de construção de moléculas de DNA recombinante
e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a
seleção do DNA recombinante.
- Sinônimos: Engenharia Genética, Manipulação gênica,
Clonagem gênica, Tecnologia do DNA recombinante, Modificação
genética e Nova genética
Tipos de Clonagem
CLONAGEM MOLECULAR
 Estudos genômicos
 Estudos de expressão de mRNAs
 Expressão de proteínas (Proteínas recombinantes)
 Vacinas de DNA
 Produção de organismo transgênicos
 Terapia Gênica
 Estudos de interação DNA-proteína ou Proteína-proteína
 Estudos de mutação sítio-dirigida de proteínas
CLONAGEM MOLECULAR
 OBJETIVO: Gerar grande número de cópias de um determinado DNA.
- Inserção de fragmentos de DNA em vetores;
- Replicação de vetores contendo o inserto dentro de células hospedeiras
- Recuperar (purificar) os fragmentos dos vetores.
CLONAGEM MOLECULAR
 Vetores: veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de
DNA a serem clonados, sejam introduzidos e propagados em uma
célula hospedeira adequada.
 Célula hospedeira: células de fácil manipulação, crescimento rápido
e constituição genética bem conhecida (ex: bactérias, leveduras,
células de cultura de tecidos de mamíferos e insetos).
Aula de Clonagem e Vetores e bibliotecas de DNA
VETORES
MOLECULARES
VETORES MOLECULARES
 São moléculas de DNA dupla fita, circular , auto-replicativas e que são
passados de geração para geração;
 Características
-Origem de replicação (Ori): multiplicar-se de maneira
independente
- Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC): Sítios para várias enzimas de
restrição
- Gene marcador (AmpR)
VETORES MOLECULARES
VETORES MOLECULARES- TIPOS
• Dependendo do tamanho do inserto de DNA e da finalidade do
experimento, muitos tipos diferentes de vetores de clonagem
podem ser utilizados para geração de moléculas recombinantes.
-Plasmídeos – clonagem de até 15.000 pb
- Fagos - clonagem de até 23.000 pb
Vetores Moleculares
Clonagem Expressão
Permite a multiplicar
as moléculas de DNA
de interesse.
Vetores de Clonagem (plasmídios)
- Permite expressar uma
proteína
- Indução da expressão
- Proteína pode ser purificada
Vetores Moleculares
Clonagem Expressão
Proteínas recombinantes-Aplicações
CLONAGEM
Clonagem Molecular
• DNA ligase: Ligar fragmentos de DNA recombinantes
Clonagem Molecular
DNA Ligase
CLONAGEM MOLECULAR
FORMAS DE COLOCAR DNA RECOMBINANTE DENTRO
DAS CÉLULAS COMPETENTES (HOST CELLS)
• Transformação bacteriana
• Transfecção (transformação em células eucariontes)
• Eletroporação (choque)
• Microinjeção
• Infecção viral
Aula de Clonagem e Vetores e bibliotecas de DNA
Aula de Clonagem e Vetores e bibliotecas de DNA
CaCl2: íons Ca²+ neutraliza carga –
dos fosfolípideos da membrana
e do DNA recombinante
Choque térmico: mudança brusca de temperatura
atraem a molécula de DNA recombinante
para dentro da célula hospedeira
Transformação
Meio de cultura enriquecido e
incubação a 37ºC para
promover recuperação das
células hospedeira
Seleção das bactérias
transformadas por cultivo em
meio de cultura contendo
ampicilina.
Transformação
Seleção dos clones
BIBLIOTECAS
MOLECULARES
BIBLIOTECAS MOLECULARES
• Conjunto de todos os genes de uma
determinada espécie armazenados
na forma de moléculas de DNA
recombinante.
BIBLIOTECAS MOLECULARES
Bibliotecas Genômicas
- Formadas a partir de DNA genômico
- DNA genômico pode ser quebrado mecanicamente ou
enzimaticamente em pedaços menores
- Clonados em fagos e plasmídios.
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Bibliotecas Moleculares
 Bibliotecas cDNA (DNA complementar)
- Representa o conteúdo de mRNA de uma
célula/tecido- Transcriptoma
- Clonagem apenas das mensagens dos genes.
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  • 1. CLONAGEM PROFª DRª PRISCILA L. MELLO ELABORADO POR: PROFª DRª MARTA F. BASTOS
  • 2. CLONAGEM • Originada da palavra grega Kólon, que designa forma de reprodução assexuada, ou seja, geração de indivíduos idênticos ao doador do DNA; • Ocorre naturalmente em organismos unicelulares e plantas; • Atualmente o termo clonagem é utilizado mais para a produção de organismos idênticos derivados de um ancestral comum.
  • 3. TIPOS DE CLONAGEM Reprodutiva - Técnica de transferência nuclear utilizada pela primeira vez com sucesso em mamíferos na geração da ovelha Dolly em 1997. - A célula de um indivíduo adulto é fundida com um óvulo sem núcleo, de forma que o "embrião" gerado possui o conteúdo genético da pessoa que doou a célula.
  • 6. Tipos de Clonagem  Terapêutica - Aprimoramento das técnicas hoje existentes para culturas de tecidos, que são realizadas há décadas. - É feita a transferência do núcleo de uma célula de uma pessoa para um óvulo sem núcleo, que ao dividir-se gera, em laboratório, células potencialmente capazes de produzir qualquer tecido.
  • 9. • Clonagem Molecular - É o processo de construção de moléculas de DNA recombinante e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a seleção do DNA recombinante. - Sinônimos: Engenharia Genética, Manipulação gênica, Clonagem gênica, Tecnologia do DNA recombinante, Modificação genética e Nova genética Tipos de Clonagem
  • 10. CLONAGEM MOLECULAR  Estudos genômicos  Estudos de expressão de mRNAs  Expressão de proteínas (Proteínas recombinantes)  Vacinas de DNA  Produção de organismo transgênicos  Terapia Gênica  Estudos de interação DNA-proteína ou Proteína-proteína  Estudos de mutação sítio-dirigida de proteínas
  • 11. CLONAGEM MOLECULAR  OBJETIVO: Gerar grande número de cópias de um determinado DNA. - Inserção de fragmentos de DNA em vetores; - Replicação de vetores contendo o inserto dentro de células hospedeiras - Recuperar (purificar) os fragmentos dos vetores.
  • 12. CLONAGEM MOLECULAR  Vetores: veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de DNA a serem clonados, sejam introduzidos e propagados em uma célula hospedeira adequada.  Célula hospedeira: células de fácil manipulação, crescimento rápido e constituição genética bem conhecida (ex: bactérias, leveduras, células de cultura de tecidos de mamíferos e insetos).
  • 15. VETORES MOLECULARES  São moléculas de DNA dupla fita, circular , auto-replicativas e que são passados de geração para geração;  Características -Origem de replicação (Ori): multiplicar-se de maneira independente - Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC): Sítios para várias enzimas de restrição - Gene marcador (AmpR)
  • 17. VETORES MOLECULARES- TIPOS • Dependendo do tamanho do inserto de DNA e da finalidade do experimento, muitos tipos diferentes de vetores de clonagem podem ser utilizados para geração de moléculas recombinantes. -Plasmídeos – clonagem de até 15.000 pb - Fagos - clonagem de até 23.000 pb
  • 18. Vetores Moleculares Clonagem Expressão Permite a multiplicar as moléculas de DNA de interesse.
  • 19. Vetores de Clonagem (plasmídios)
  • 20. - Permite expressar uma proteína - Indução da expressão - Proteína pode ser purificada Vetores Moleculares Clonagem Expressão
  • 24. • DNA ligase: Ligar fragmentos de DNA recombinantes Clonagem Molecular
  • 27. FORMAS DE COLOCAR DNA RECOMBINANTE DENTRO DAS CÉLULAS COMPETENTES (HOST CELLS) • Transformação bacteriana • Transfecção (transformação em células eucariontes) • Eletroporação (choque) • Microinjeção • Infecção viral
  • 30. CaCl2: íons Ca²+ neutraliza carga – dos fosfolípideos da membrana e do DNA recombinante Choque térmico: mudança brusca de temperatura atraem a molécula de DNA recombinante para dentro da célula hospedeira Transformação
  • 31. Meio de cultura enriquecido e incubação a 37ºC para promover recuperação das células hospedeira Seleção das bactérias transformadas por cultivo em meio de cultura contendo ampicilina. Transformação
  • 34. BIBLIOTECAS MOLECULARES • Conjunto de todos os genes de uma determinada espécie armazenados na forma de moléculas de DNA recombinante.
  • 35. BIBLIOTECAS MOLECULARES Bibliotecas Genômicas - Formadas a partir de DNA genômico - DNA genômico pode ser quebrado mecanicamente ou enzimaticamente em pedaços menores - Clonados em fagos e plasmídios.
  • 37. Bibliotecas Moleculares  Bibliotecas cDNA (DNA complementar) - Representa o conteúdo de mRNA de uma célula/tecido- Transcriptoma - Clonagem apenas das mensagens dos genes. - É mais seletiva - Isolamento de genes específicos
  • 38. Bibliotecas de cDNA • Dependente da síntese de um cDNA a partir de um mRNA - Transcriptase reversa Extração de RNA total
  • 39. Bibliotecas de cDNA RNA total Purificação do mRNA