O documento descreve os diferentes tipos de clonagem, incluindo a clonagem reprodutiva, terapêutica e molecular. A clonagem molecular envolve a construção de moléculas de DNA recombinante usando vetores e células hospedeiras para gerar cópias do DNA de interesse.

1. CLONAGEM
PROFª DRª PRISCILA L. MELLO
ELABORADO POR: PROFª DRª MARTA F. BASTOS

2. CLONAGEM
• Originada da palavra grega Kólon, que designa forma de reprodução
assexuada, ou seja, geração de indivíduos idênticos ao doador do DNA;
• Ocorre naturalmente em organismos unicelulares e plantas;
• Atualmente o termo clonagem é utilizado mais para a produção de
organismos idênticos derivados de um ancestral comum.

3. TIPOS DE CLONAGEM
Reprodutiva
- Técnica de transferência nuclear utilizada pela primeira vez
com sucesso em mamíferos na geração da ovelha Dolly em 1997.
- A célula de um indivíduo adulto é
fundida com um óvulo sem núcleo, de
forma que o "embrião" gerado possui
o conteúdo genético da pessoa que
doou a célula.

4. Clonagem Reprodutiva

5. Clonagem Reprodutiva

6. Tipos de Clonagem
 Terapêutica
- Aprimoramento das técnicas hoje existentes para
culturas de tecidos, que são realizadas há décadas.
- É feita a transferência do núcleo de uma célula de
uma pessoa para um óvulo sem núcleo, que ao dividir-se
gera, em laboratório, células potencialmente capazes de
produzir qualquer tecido.

7. Clonagem Terapêutica

8. Terapêutica x Reprodutiva

9. • Clonagem Molecular
- É o processo de construção de moléculas de DNA recombinante
e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a
seleção do DNA recombinante.
- Sinônimos: Engenharia Genética, Manipulação gênica,
Clonagem gênica, Tecnologia do DNA recombinante, Modificação
genética e Nova genética
Tipos de Clonagem

10. CLONAGEM MOLECULAR
 Estudos genômicos
 Estudos de expressão de mRNAs
 Expressão de proteínas (Proteínas recombinantes)
 Vacinas de DNA
 Produção de organismo transgênicos
 Terapia Gênica
 Estudos de interação DNA-proteína ou Proteína-proteína
 Estudos de mutação sítio-dirigida de proteínas

11. CLONAGEM MOLECULAR
 OBJETIVO: Gerar grande número de cópias de um determinado DNA.
- Inserção de fragmentos de DNA em vetores;
- Replicação de vetores contendo o inserto dentro de células hospedeiras
- Recuperar (purificar) os fragmentos dos vetores.

12. CLONAGEM MOLECULAR
 Vetores: veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de
DNA a serem clonados, sejam introduzidos e propagados em uma
célula hospedeira adequada.
 Célula hospedeira: células de fácil manipulação, crescimento rápido
e constituição genética bem conhecida (ex: bactérias, leveduras,
células de cultura de tecidos de mamíferos e insetos).

14. VETORES
MOLECULARES

15. VETORES MOLECULARES
 São moléculas de DNA dupla fita, circular , auto-replicativas e que são
passados de geração para geração;
 Características
-Origem de replicação (Ori): multiplicar-se de maneira
independente
- Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC): Sítios para várias enzimas de
restrição
- Gene marcador (AmpR)

16. VETORES MOLECULARES

17. VETORES MOLECULARES- TIPOS
• Dependendo do tamanho do inserto de DNA e da finalidade do
experimento, muitos tipos diferentes de vetores de clonagem
podem ser utilizados para geração de moléculas recombinantes.
-Plasmídeos – clonagem de até 15.000 pb
- Fagos - clonagem de até 23.000 pb

18. Vetores Moleculares
Clonagem Expressão
Permite a multiplicar
as moléculas de DNA
de interesse.

19. Vetores de Clonagem (plasmídios)

20. - Permite expressar uma
proteína
- Indução da expressão
- Proteína pode ser purificada
Vetores Moleculares
Clonagem Expressão

21. Proteínas recombinantes-Aplicações

22. CLONAGEM

23. Clonagem Molecular

24. • DNA ligase: Ligar fragmentos de DNA recombinantes
Clonagem Molecular

25. DNA Ligase

26. CLONAGEM MOLECULAR

27. FORMAS DE COLOCAR DNA RECOMBINANTE DENTRO
DAS CÉLULAS COMPETENTES (HOST CELLS)
• Transformação bacteriana
• Transfecção (transformação em células eucariontes)
• Eletroporação (choque)
• Microinjeção
• Infecção viral

30. CaCl2: íons Ca²+ neutraliza carga –
dos fosfolípideos da membrana
e do DNA recombinante
Choque térmico: mudança brusca de temperatura
atraem a molécula de DNA recombinante
para dentro da célula hospedeira
Transformação

31. Meio de cultura enriquecido e
incubação a 37ºC para
promover recuperação das
células hospedeira
Seleção das bactérias
transformadas por cultivo em
meio de cultura contendo
ampicilina.
Transformação

32. Seleção dos clones

33. BIBLIOTECAS
MOLECULARES

34. BIBLIOTECAS MOLECULARES
• Conjunto de todos os genes de uma
determinada espécie armazenados
na forma de moléculas de DNA
recombinante.

35. BIBLIOTECAS MOLECULARES
Bibliotecas Genômicas
- Formadas a partir de DNA genômico
- DNA genômico pode ser quebrado mecanicamente ou
enzimaticamente em pedaços menores
- Clonados em fagos e plasmídios.

36. BIBLIOTECAS GENÔMICAS

37. Bibliotecas Moleculares
 Bibliotecas cDNA (DNA complementar)
- Representa o conteúdo de mRNA de uma
célula/tecido- Transcriptoma
- Clonagem apenas das mensagens dos genes.
- É mais seletiva
- Isolamento de genes específicos

38. Bibliotecas de cDNA
• Dependente da síntese de um cDNA a partir de um mRNA
- Transcriptase reversa
Extração de
RNA total

39. Bibliotecas de cDNA
RNA total
Purificação do
mRNA

40. DNA Genômico x cDNA