O documento descreve as técnicas de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) e RFLP (Polimorfismo de Comprimento dos Fragmentos de Restrição) para análise de DNA. A PCR permite a amplificação exponencial de segmentos específicos de DNA. O RFLP envolve a digestão de DNA com enzimas de restrição para identificar polimorfismos. Essas técnicas têm aplicações importantes como diagnóstico médico e de doenças genéticas.

1. TÉCNICAS DE ANÁLISE DE DNA
PCR
O que é a PCR?
A PCR (Reacção de Polimerização em Cadeia) é uma metodologia que se baseia na
amplificação exponencial selectiva de uma quantidade reduzida de DNA de uma única célula. Esta
técnica revolucionou o mundo científico e as suas aplicações são imensas: é usada no diagnóstico
médico, mapeamento genético, detecção de doenças hereditárias, clonagem de genes, testes de
paternidade, identificação de “impressões digitais” genéticas… De facto, a PCR revolucionou
várias áreas como a Biologia Molecular, Patologia, Farmácia, Botânica, Medicina Forense e valeu o
prémio Nobel, em 1993, a Kary Mullis.
Objectivo
O objectivo da PCR é produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de
DNA a partir de uma quantidade mínima. O DNA
molde sofre uma amplificação controlada por
enzimas, obtendo-se milhões de cópias do fragmento
de DNA de interesse. O molde pode ser qualquer
forma de DNA de cadeia dupla, como o DNA
genómico: pode usar-se uma gota de sangue, um fio
de cabelo, uma célula do epitélio oral, um
blastómero…
Em que consiste um ciclo de PCR?
Um ciclo de PCR (Fig.1) consiste em três
fases: desnaturação do DNA molde (a 95ºC), ligação (“annealing”) dos primers (a 64ºC) e
polimerização do DNA (a 72ºC). Na 1ª etapa faz-se a separação das cadeias de dupla hélice de
DNA através do calor. Esta separação é essencial para que, na 2ª fase, dois primers de

2. oligonucleótidos se liguem às sequências dos pares de bases complementares da cadeia molde.
Estes primers são desenhados e sintetizados de modo a ligarem-se às extremidades opostas de cada
uma das cadeias de DNA molde que se pretende amplificar. Os primers servem, portanto, de ponto
de partida para a replicação de DNA e, na última etapa, faz-se a sua extensão. A enzima responsável
por esta polimerização é a DNA polimerase termo-estável (Taq), tendo sido isolada a partir da
bactéria termofílica Thermus aquaticus que vive em elevadas temperaturas. É essencial que a
enzima usada seja estável ao calor, uma vez que os ciclos de PCR têm lugar a temperaturas situadas
entre os 64ºC e 95ºC. Para executar este ciclo usa-se um termociclador, que faz variar de forma
Fig. 1 – Ciclo do PCR.
rigorosa o tempo e a temperatura ao longo do ciclo. Normalmente são repetidos cerca de 30 ciclos,
o que demora apenas algumas horas.
Assim, duas novas cadeias são sintetizadas a partir da cadeia molde em cada ciclo completo
de PCR logo dá-se um crescimento exponencial, havendo ao fim de n ciclos 2n vezes mais cópias do
que no início.
Vantagens e limitações
O segredo do sucesso da PCR reside na capacidade que ela tem de amplificar uma sequência
precisa de DNA aliada à sua simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade. Não é
necessário isolar o DNA que se pretende amplificar (mesmo que se encontre misturado com DNA
de outras espécies), uma vez que a especificidade da PCR é dada pelos primers. É uma técnica
rápida, barata e segura.
Contudo, a PCR também tem limitações, como a necessidade de conhecer a sequência de
DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers específicos. Outras desvantagens são a
relativa facilidade com que ocorre contaminação da amostra por DNA estranho (uma vez que se
trata de uma técnica muito sensível) e a limitada extensão da sequência que é possível amplificar (é
difícil aplicar a PCR a sequências maiores do que 5kb). Pode também ocorrer incorporação errónea
de bases durante a replicação.
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3. Aplicações
Os resultados da PCR são úteis no diagnóstico, prognóstico, determinação da terapia a ser
utilizada, e até mesmo na avaliação da susceptibilidade a doenças. A PCR é frequentemente
utilizada na detecção de polimorfismos, mutações pontuais e infecção por microorganismos
bacterianos ou virais antes da exteriorização patológica da sua presença. É particularmente
importante na detecção do SIDA, pois consegue detectar o vírus HIV nas primeiras semanas após a
infecção e mais rapidamente do que o método normalmente utilizado, o teste ELISA. A PCR
procura directamente pelo DNA do vírus enquanto que o teste ELISA é mais indirecto, pois procura
anticorpos que o organismo possa ter produzido contra o vírus.
Outro exemplo de aplicação da PCR é no DPI (diagnóstico pré-implantatório) e no DPN
(diagnóstico pré-natal). A PCR pode ser usada em DPN em idades gestacionais tão precoces como
as 9 semanas, permitindo, por exemplo, a detecção de células de um feto masculino em circulação
no sangue materno, ainda que exista em quantidades muito reduzidas, e averiguar a compatibilidade
entre o grupo sanguíneo da mãe e do feto. Permite ainda a detecção de várias anormalidades
cromossómicas como a trissomia 21. Este exame ao diagnosticar previamente certas doenças,
possibilita que os pais e equipa de saúde decidam antecipadamente a melhor atitude a tomar em
relação a cada caso.
RFLP
O que é o RFLP?
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) é uma técnica em que os organismos
podem ser diferenciados pela análise de padrões derivados da clivagem do seu DNA. Se dois
organismos diferirem na distância entre os sítios de clivagem de uma endonuclease de restrição, o
comprimento dos fragmentos produzidos vai diferir quando o DNA for digerido com uma enzima
de restrição.
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4. Metodologia
Para a detecção de RFLP’s, pode ser usada a metodologia de “Shouthern Blotting”, descrita
em 1975 por Edmund Southern. Após restrição enzimática os fragmentos de DNA genómico são
sujeitos a electroforese em gel e posteriormente transferidos para um suporte sólido de nitrocelulose
através do arrastamento por capilaridade. Após hibridização com sondas radioactivas este processo
possibilita a identificação, entre milhares de fragmentos de restrição obtidos, de sequências bem
determinadas.
Aplicações
Com o aumento da informação da sequência genética um grande número de doenças genéticas
podem ser determinadas através da análise do RFLP:
1) A anemia falciforme é uma doença
genética em que ambos os genes no paciente
substituem um T por um A na posição do meio do
codão 6. Isto converte o codão GAG (para o
glutamato) ao codão GTG (para a valina) e elimina
Fig. 3 - Linhagem de uma família em que o filho é
o único a possuir anemia falciforme. e sequência reconhecida (CTGAGG que é comum
aos codões 5, 6 e 7) e é cortada por uma das enzimas de restrição. Quando o gene normal (beta a) é
digerido com uma enzima de restrição e os fragmentos são separados por electroforese a sonda liga-
se a um pequeno fragmento (entre as setas vermelhas). Quando é o gene doente (beta s) a enzima
não pode cortá-lo neste sítio, então a sonda liga-se a um fragmento muito maior (Fig. 3). Neste
exemplo, uma mudança de um único nucleotídio produz o RFLP. Isto é uma causa comum de
RFLP’s e estes polimorfismos são actualmente referidos como SNP’s (Single Nucleotide
Polymorphisms).
2) A fibrose cística (FC) é uma doença hereditária que faz certas glândulas produzirem
secreções anormais, resultando disso vários sintomas, os mais importantes afectando o trato
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5. digestivo e os pulmões. A FC é uma doença recessiva, pelo que qualquer pessoa com FC deve ser
homozigótica para os alelos da doença. Se os progenitores requererem aconselhamento genético
recorre-se à análise de RFLP que é realizada ao seu DNA. Os RFLP’s para a FC são conhecidos,
portanto é fácil determinar se uma pessoa é homozigótica normal, heterozigótica portadora ou
homozigótica com FC (Fig. 4).
Fig.4 – Análise do RFLP para a FC.
Limitações
1) As mutações que causam a maior parte das doenças genéticas humanas são mais variadas
do que a única mutação associada à anemia falciforme. 2) Existem muitas doenças que resultam de
vários genes mutantes trabalhando juntos para produzir o fenótipo da doença. 3) Ainda existem
doenças genéticas para as quais o gene ainda não foi descoberto. Até o gene poder ser localizado,
clonado e sequenciado nenhuma sonda pode ser feita para o detectar directamente.
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6. digestivo e os pulmões. A FC é uma doença recessiva, pelo que qualquer pessoa com FC deve ser
homozigótica para os alelos da doença. Se os progenitores requererem aconselhamento genético
recorre-se à análise de RFLP que é realizada ao seu DNA. Os RFLP’s para a FC são conhecidos,
portanto é fácil determinar se uma pessoa é homozigótica normal, heterozigótica portadora ou
homozigótica com FC (Fig. 4).
Fig.4 – Análise do RFLP para a FC.
Limitações
1) As mutações que causam a maior parte das doenças genéticas humanas são mais variadas
do que a única mutação associada à anemia falciforme. 2) Existem muitas doenças que resultam de
vários genes mutantes trabalhando juntos para produzir o fenótipo da doença. 3) Ainda existem
doenças genéticas para as quais o gene ainda não foi descoberto. Até o gene poder ser localizado,
clonado e sequenciado nenhuma sonda pode ser feita para o detectar directamente.
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7. digestivo e os pulmões. A FC é uma doença recessiva, pelo que qualquer pessoa com FC deve ser
homozigótica para os alelos da doença. Se os progenitores requererem aconselhamento genético
recorre-se à análise de RFLP que é realizada ao seu DNA. Os RFLP’s para a FC são conhecidos,
portanto é fácil determinar se uma pessoa é homozigótica normal, heterozigótica portadora ou
homozigótica com FC (Fig. 4).
Fig.4 – Análise do RFLP para a FC.
Limitações
1) As mutações que causam a maior parte das doenças genéticas humanas são mais variadas
do que a única mutação associada à anemia falciforme. 2) Existem muitas doenças que resultam de
vários genes mutantes trabalhando juntos para produzir o fenótipo da doença. 3) Ainda existem
doenças genéticas para as quais o gene ainda não foi descoberto. Até o gene poder ser localizado,
clonado e sequenciado nenhuma sonda pode ser feita para o detectar directamente.
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