1.
Engenharia Genética<br />Isabel Lopes<br />

2.
A molécula de DNA<br />Intocável (1950-1975)<br />A partir de década de 70, foi possível abri-la, extrair genes, transplantá-los, multiplicá-los<br />Conhecer doenças humanas<br />Transformar organismos…<br />IL 2010<br />

3.
Como encontrar um gene?Como isolá-lo?<br />Uso de enzimas de restrição<br />Cortam a molécula de DNA em zonas específicas, sempre que as encontram.<br />Presentes em bactérias, que as usam como mecanismo de defesa contra os vírus que as atacam (bacteriófagos).<br />IL 2010<br />

4.
Enzimas de restrição<br />Endonucleases de restrição<br />Enzimas presentes nas bactérias que cortam a cadeia de DNA em zonas específicas – zonas de restrição<br />Fragmentam o DNA em fragmentos mais pequenos que contêm na extremidade a sequência reconhecida.<br />IL 2010<br />

5.
Enzima de restrição Eco RI<br />Por exemplo a enzima Eco RI reconhece a sequência:<br />5´GAATTC3´<br />IL 2010<br />

6.
Enzima de restrição Eco RI<br />Por exemplo a enzima Eco RI reconhece a sequência:<br />5´GAATTC3´ <br />fará o corte entre o nucleótido de guanina e o nucleótido de adenina em cada cadeia.<br />IL 2010<br />Extremidades coesivas<br />

7.
Ligases do DNA<br />Molécula DNA 2<br />Molécula DNA 1<br />Permitem catalizar as reacções em que as extremidades livres são ligadas a novas sequências de DNA (novo gene) por complementaridade de bases. <br />IL 2010<br />DNA Recombinante<br />Molécula DNA 3<br />

8.
Técnica do DNA recombinante<br />Cada fragmento de DNA, que foi separado do resto da molécula, contém um ou mais genes. <br />Cada gene permite a síntese de uma proteína, por isso ao estudarmos o gene estamos a estudar a proteína que ele codifica.<br />Isolando fragmentos de DNA (genes) podem transferir-se para outro organismo.<br />Como fazer a transferência?<br />IL 2010<br />

9.
Técnica do DNA recombinante“Vector”<br />É necessário usar um vector, uma entidade que possa transferir o gene do organismo (de onde foi retirado) para o organismo que o vai receber<br />Vectores mais importantes: <br />plasmídio* de bactérias<br />IL 2010<br />Os plasmídio é uma molécula de DNA circular não ligada ao cromossoma, e que se encontra no hialoplasma das bactérias. Multiplica-se a cada divisão celular, passando uma cópia para cada célula “filha”.<br />

10.
Técnica do DNA recombinante“Corte e isolamento do gene”<br />A mesma enzima corta o DNA dador, de forma a isolar o gene que se pretende inserir no plasmídeo.<br />A enzima de restrição corta o DNA do plasmídeo num ponto específico.<br />IL 2010<br />

11.
Técnica do DNA recombinante“Introdução no plasmídeo”<br />O gene a inserir é colocado em contacto com o plasmídeo, juntamente com ligases do DNA (enzimas).<br />O gene passa a fazer parte do plasmídeo, que possui agora um DNA recombinante<br />IL 2010<br />

12.
Técnica do DNA recombinante“Propagação”<br />O plasmídeo recombinante em contacto com bactérias introduz-se em algumas delas.<br />As bactérias portadoras do plasmídeo sintetizam agora a proteína desejada.<br />Como saber quais as bactérias portadoras do DNA recombinante?<br />IL 2010<br />

13.
Técnica do DNA recombinante“Selecção”<br />Os plasmídeos usados possuem genes que lhes conferem resistência a determinados antibióticos. <br />Num meio com determinado antibiótico, sobreviverão apenas as bactérias resistentes, e portanto portadoras do gene pretendido (com DNA recombinante).<br />IL 2010<br />

14.
IL 2010<br />

15.
Técnica do DNA recombinante“Aplicações”<br /> Estudos de mecanismos de replicação e expressão de genes<br /> Determinação da sequência de um gene (e proteína codificada)<br />Aumento no rendimento de plantas<br /> Obtenção de organismos geneticamente modificados capazes de produzir substâncias úteis (ex.: insulina humana)<br />…<br />IL 2010<br />

16.
IL 2010<br />

17.
Técnica do DNA complementar<br />Para obtenção de insulina humana:<br />Antes: Uso de insulina obtida a partir do pâncreas de vacas ou de porcos (provocava por vezes rejeição)<br />Solução?<br /><ul><li>Uso do RNAm existente nas células do pâncreas humano

18.
Recurso a uma enzima existente nos vírus: transcriptase reversa (catalisa a formação de DNA a partir de RNA)</li></ul>IL 2010<br />

19.
Formação de cDNA<br />A molécula de RNAm, serve de molde à sintese de uma molécula de DNA<br />(já sem intrões e por isso funcional)<br />IL 2010<br />

20.
Formação de cDNA<br />O gene isolado que codifica a síntese de insulina pode agora ser inserido numa bactéria e iniciar-se a produção industrial de insulina<br />IL 2010<br />

21.
Reacções de polimerização em cadeia (PCR)<br />Quando é necessária uma quantidade de DNA superior à disponível, como obtê-la?<br />Casos que envolvem as ciências forenses<br />Na década de 80, passou a utilizar-se a técnica do PCR para fazer milhares de cópias de um único segmento de DNA. <br />IL 2010<br />

22.
PCR<br />Técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase(enzima que faz a replicação do DNA).<br />Osprimers são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é se ligam por complementaridade ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar. <br />IL 2010<br />

23.
PCR<br />Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de primers diferentes<br />IL 2010<br />

24.
PCR<br /><ul><li> Obtêm-se uma amostra mínima de DNA de uma célula humana.

25.
A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleótidos de DNA e os primers complementares a sequência de DNA são colocados em um tubo de ensaio.

26.
Coloca-se o tubo de ensaio numa máquina de PCR (maquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e arrefecimento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa. </li></ul>IL 2010<br />Adaptado de http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/recombinante.php<br />

27.
PCR<br /><ul><li> Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla cadeia) o DNA.

28.
Cada cadeia simples do DNA desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso submete-se a 54ºC onde os primers servem de iniciadores para a enzima polimerase.

29.
Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase) para a duplicação da cadeia - ligação dos nucleotídos livres por complementaridade à cadeia de DNA ,formando assim uma nova cadeia dupla.

30.
Repete-se até obtenção da quantidade necessária.</li></ul>IL 2010<br />Adaptado de http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/recombinante.php<br />

31.
IL 2010<br />

32.
Vamos investigar…<br />O caso do “chupa-chupa lambido”, e terás de o resolver. Terás a mais avançada tecnologia forense ao teu lado: Os perfis de ADN. <br />Experimenta este cenário interactivo, do Web site NOVA: &quot;TrailTheKiller&apos;s&quot;, que te guia pelo processo de criação de perfis de ADN de diversos suspeitos de crimes e pelas provas deixadas na cena do crime. Depois vais comparar os perfis que obtiveste e esperançosamente, encontrar o criminoso… (clica no ?) <br />IL 2010<br />

33.
Vamos investigar…<br />Este excerto de vídeo do web site NOVA: &quot;TrailTheKiller&apos;s&quot; segue uma equipa de peritos que investigam a evidência forense de 1954 referente ao assassinato de MarilynSheppard, um dos crimes mais famosos e não resolvidos na história dos E.U.A.<br />IL 2010<br />