4. Métodos de melhoramento
Germoplasma
Seleção e avaliação agronômica
Seleção Indução à mutação
Variação somaclonal Hibridação convencional
Transformação genética
Hibridação somática
(Fusão de protoplastos)
Variedade comercial
Métodos aplicados ao melhoramento
genético de plantas
5. Melhoramento tradicional
• Seleção de genótipos em plantas são
necessários vários ciclos de seleções e
recombinações;
• Características de interesse são geralmente
poligênicas,
• Herança complexa, difícil identificação;
• Grande número de cruzamentos;
• Muito esforço e planejamento;
• Polimorfismo limitado para ligação gênica
7. Até 1960 – Marcadores morfológicos
1.Primeira versões dos mapas genéticos;
2.Associação das marcas com características fenotípicas;
3.Restrito a poucas plantas (tomate, ervilha, milho);
4.Número reduzido de marcadores para um enorme
espectro de espécies vegetais;
5.Influência do ambiente e ação gênica;
6.Identificados a nivel de planta inteira ou adulta.
8.
9. DETECÇÃO DO DOGMA CENTRAL
DNA armazena
a informação
RNA transfere
a informação
Proteína executa
a função
DNA armazena
a informação
RNA transfere
a informação
Proteína executa
a função
genes ambiente FENÓTIPO
10. Ampliação dos marcadores moleculares
MARCADORES
Morfológicos Bioquímicos
Marcadores moleculares
DNA RNA
11. deve ser capaz de diferenciar progenitores
deve ser reproduzido com precisão na progênie
Do ponto de vista molecular, um marcador genético (ou loco marcador)
serve para identificar um local ou uma região de um cromossomo.
Um marcador genético ideal deve apresentar uma série de atributos:
alto nível de polimorfismo
estabilidade em diferentes ambientes
detectar grande número de locos não ligado
Marcador genético é uma característica que é capaz de
detectar diferenças entre dois ou mais indivíduos ou
organismos.
13. Marcadores moleculares
• São neutros em relação a efeitos epistáticos ou
pleitrópicos;
• Identificação de genótipos em estádios iniciais da planta;
• Acelera o processo de seleção e de recombinações
desejáveis.
• Todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um
gene expresso (isoenzimas, proteínas, RNAm);
• ou de um segmento específico de DNA (regiões
expressas ou não do genoma).
14. Três grandes aplicações
• Análise da diversidade genética entre
indivíduos
• Construção de mapas genéticos de
ligação
• Seleção assistida por marcadores
moleculares (SAM)
15. Classes dos marcadores
Isoenzimas
Proteinas de sementes
RFLP, minissatélites
(VNTR)
RAPD, SSR, rDNA - ITS
AFLP; cDNA+AFLP
bioquímicos
restrição e
hibridação de
sequências de
dna
reação
polimerase em
cadeia (PCR)
PCR + restrição
+ DNA
recombinante
PCR específicos
em organelas
MitDNA, cpSSR
17. •O termo eletroforese foi criado
por Michaelis em 1909, descreve
migração de moléculas sob a
influência de um campo elétrico;
•Separação dos fragmentos da
molécula de DNA, RNA e
proteínas em gel
•Separação em função de suas
cargas elétricas, de seus pesos
moleculares e de suas
conformações.
Eletroforese
22. Eletroforese de isoenzimas
* Isoenzimas - diferentes formas moleculares (variantes) de uma
mesma enzima, apresentando função idêntica ou similar,
presente num mesmo indivíduo (Markert & Moller, 1959).
Gel de Araucaria angustifolia
6PGDH -CM
MANTOVANI, 2003
Co-dominância
23. Isoenzimas
• Distintas formas de uma mesma enzima, as
isoenzimas, codificadas por diferentes
alelos, podem ser detectadas em
diferentes regiões do gel, caso apresentem
diferentes mobilidades eletroforéticas
• Cada banda revelada no gel se constitui
num marcador genético, pois entende-se
por marcador genético a constituição
genotípica de um loco num determinado
indivíduo
24. Aplicações das isoenzimas
• Kessel e Milchemore (1986) e Falcão e Contel
(1991) - abordam que as variações
isoenzimáticas são de grande importância nos
estudos genéticos:
• Indicadores dos níveis de polimorfismo
• Relacionamento filogenético
• Identificação de raças, espécies e populações
• Valiosa ferramenta para estudos evolutivos e
taxonômicos.
25. Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
MANTOVANI, 2003
Resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas
Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
MANTOVANI, 2003
Resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas
27. Genética de Populações
Teorema de Hardy-Weinberg
Em populações infinitamente grandes,
com cruzamentos ao acaso (panmítica),
que não estiverem sofrendo influência dos
fatores evolutivos (mutações, seleção
natural, migrações), não haverá alteração do
pool gênico, isto é, as freqüências gênicas e
genotípicas se manterão constantes.
28. ORGANIZAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA
• Base para um programa pré-melhoramento
• Caracterização morfológica e molecular
• Caracterização de bancos de germoplasma
• Coleções e seleções disponíveis em programas de melhoramento
• Cultivares comerciais
30. Reação de polimerase em cadeia (PCR)
Amplificação do DNA
Técnica usada para amplificar uma região específica de
DNA visando produzir quantidade de DNA suficiente
31. Extração de DNA (Doyle e Doyle, 1987)
Amostra
Sol. extratora
pellet
1.5
1.0
0.5
Adição de CIA
1.5
1.0
0.5
Adição de CIA
1.5
1.0
0.5
Adição de CIA
Centrifugação
RNAse
32. Constatações
• Logo após Kary Mullis ter descoberto a Polymerase Cadeia
Reação (PCR) ele percebeu que primers curtos ligariam a
vários locais em um genoma e assim poderiam produzir
fragmentos múltiplos.
• Welsh & McClelland (1990) e Williams et al. (1990)
desenvolveram Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) -
técnica que utiliza primer com 10 bases,
• O uso da reação da polimerização em cadeia (PCR)
proporciona a amplificação de um segmento de DNA,
delimitado por dois iniciadores (primers) com 10 pares de
bases, que são complementares a dois sítios, um em cada
fita do DNA, posicionados inversamente a uma distância
geralmente não superior a 4kb.
33. DNA
Primers encontram-se na mesma direção,
amplificação NÃO acontecerá
Primer se anela a muitos locais no DNA
Quando primer se anela em direção oposta – amplificação
34. DNA
Primers são separados em pouca distância,
fragmento É AMPLIFICADO
100 - 1,500 bases
RAPD
Dominante
41. Microsatélites
• SSR – Simple Sequence Repeats
– Pequenas sequências (“sequence motif”) com 1 a 4 nucleotídeos
repetidos em tandem - Amplificados via PCR
– Classe de marcadores moleculares mais polimórficos
Sinonímias
SSR (Simple Sequence Repeats);
STMS (Sequence Tagged Microsatellites);
SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);
Onde são encontrados ???
Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)
Plantas: (AT)n
Mitocôndrias
Cloroplastos
48. Mapeamento genético de ligação
• Identificar marcadores genéticos ligados aos genes de interesse,
nos respectivos cromossomos;
•Disponibilizados para as principais espécies de importância
agronômica;
•QTLs e/ou QRLs rastreados e etiquetados,
visando uma melhoria na eficiência da seleção.
Xu & Korban, 2000
Gene Vf
(Sarna)
AFLP
55. Desenvolvimento de um SCAR
(Sequence characterized amplified RAPD)
1) identificação de um iniciador que confere polimorfismo
a dois bulks de DNA com fenótipos contrastantes,
2) o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado
em um vetor (plasmideo),
3) sequenciamento do fragmento isolado,
4) desenho dos iniciadores de tamanho maior que os
decâmeros,
5) teste final em plantas.
56. Validação das Marcas – Desenvolvimentos de
marcadores específicos (Clonagem por mapeamento)
58. Atributos Isoenzimas
Proteínas
de sementes RFLPs RAPDs Microssatélites AFLPs
Nível de
Polimorfismo
baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto
Estabilidade
ambiental
moderada alta alta alta alta alta
Número de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto
Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante
Número de alelos por
loco
2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2
Distribuição no
genoma
regiões de cópia
única
regiões de cópia
única
várias ao acaso ao acaso ao acaso
Acessibilidade
tecnológica
muito alta muito alta média muito alta muito baixa média
Aplicabilidade no
melhoramento
rápido,
baixo custo
rápido,
baixo custo
lento,
custo médio
rápido, baixo
custo
lento, custo alto rápido, custo
baixo
Identificação de
genótipos
baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta
Avaliação de
germoplasma
média baixa alta alta alta muito alta
Mapeamento
genético
baixa muito baixa alta alta muito alta alta
Mapeamento de
regiões específicas
baixa inadequado média muito alta média muito alta
Mapeamento
comparativo
baixa inadequado muito alta baixa alta baixa
Genética de
Autógamas
baixa baixa média alta muito alta muito alta
Genética de
Alógamas
média baixa média alta muito alta muito alta
Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média
Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).