Introdução de tecnicas de diagnostico molecular

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Introdução de tecnicas de diagnostico molecular

  1. 1. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULARProf. Dr. Paulo Queiroz Profa. Dra. Ruscaia Dias Teixeira
  2. 2. DIAGNÓSTICO MOLECULARAvaliação da estrutura dos componentes do DNA
  3. 3. DIAGNÓSTICO MOLECULARÉ um campo emergente na área de análises clínicas laboratoriais.
  4. 4. DIAGNÓSTICO MOLECULARDetecta Agentes infecciosos (Ex: HPV)
  5. 5. DIAGNÓSTICO MOLECULARDetecta alterações genéticas do próprio organismoAuxilia no diagnóstico e prognóstico dessas doenças
  6. 6. DIAGNÓSTICO MOLECULARIdentifica pessoas (criminosos ou cadáveres) • Existem sequências que se repetem no nosso genoma. • O número de repetições pode variar de pessoa para pessoa • Ao reconhecer sítios com pedaços de DNA com variados números de cópias em série, podemos distinguir duas pessoas .
  7. 7. DIAGNÓSTICO MOLECULARDetermina paternidade ou graus de parentesco. (filhos possuem metade dos alelos maternos e metade dos alelos do pai)
  8. 8. DIAGNÓSTICO MOLECULAR Auxilia na determinação da terapia a ser utilizadaMutação no gene SHOX Mutação no gene GHRTratamento com GH Insensibilidade ao GH TRATAMENTO DE BAIXA ESTATURA
  9. 9. DIAGNÓSTICO MOLECULAR Avalia a suscetibilidade a doença Gene APP Associado ao maior risco de desenvolvimento de Alzheimer Síntese de PPA em cérebros normais Beta – amilóide – clivagens anormais da PPAAlzheimer Placas amielóides
  10. 10. CONCEITOS IMPORTANTES
  11. 11. GENE
  12. 12. Splicing
  13. 13. MUTAÇÃO GÊNICAGene com sua função alterada, levando ao aparecimento de doenças. Adição ou subtração de bases Substituição de bases
  14. 14. ANEMIA FALCIFORME
  15. 15. ALELOS Forma alternativa do mesmo geneOcupam o mesmo locus em cromossomos homólogos
  16. 16. cDNADNA sintetizado a partir de uma molécula de mRNA, cujos íntrons já foram removidos, numa reação catalisada pela enzima transcriptase reversa.
  17. 17. PRIMERS
  18. 18. SÍTIOS DE RESTRIÇÃO
  19. 19. REPETIÇÕES EM TANDEM • Sequências curtas • Idênticas ou similares • em tandem (agrupadas) ou dispersas pelo genoma. • em tandem: DNAs satélite • No repetições: variam em cada indivíduo, tornando-os únicos. • Formam uma espécie de “impressão digital” do DNA.
  20. 20. INDICAÇÃO DOS TESTESMOLECULARES
  21. 21. DIAGNÓSTICO1. Doenças infecciosas2. Doenças genéticas3. Câncer
  22. 22. 1. DOENÇAS INFECCIOSAS• Detecção rápida de microrganismos de: – Crescimento lento • Mycobacterium kansaii – lesões pulmonares – Não cultiváveis • Treponema pallidum (bactéria agente da Sífilis) • bacilo Mycobacterium leprae (micobactéria agente da lepra)
  23. 23. 1. DOENÇAS INFECCIOSAS Streptococcus pneumoniae X penicilinaDeterminação de resistência antimicrobiana
  24. 24. 1. DOENÇAS INFECCIOSASMonitoramento de doenças através da quantificação da infecção.
  25. 25. 2. DOENÇAS INFECCIOSASTESTES MOLECULARES MAIS COMUNS:• Avaliação de carga viral para: – HIV – Hepatite C
  26. 26. 2. GENÉTICA HUMANA• Diagnóstico das doenças monogênicas: – identificação do gene afetado – mutação responsável pela doença • Fibrose cística (gene CFTR – produção de muco e sucos gástricos) • Síndrome de Marfan (gene Fibrilina – formação das fibras elásticas) • Distrofia muscular de Duchene (gene distrofina – permeabilidade celular das fibras musculares)
  27. 27. 2. GENÉTICA HUMANA Identificação de portadores heterozigotosDoenças falciforme Genótipos : Hb AS (heterozigoto de Hb S) - traço falciforme Hb AA (padrão normal) Hb SS (homozigose de Hb S) – anemia falciforme Hb SC (dupla heterozigose de Hb S e Hb C) – doença falciforme
  28. 28. 2. GENÉTICA HUMANA Diagnóstico pré-natal• líquido amniótico – descamações fetais
  29. 29. 2. GENÉTICA HUMANA Predisposição a doenças genéticasApolipoproteina E VLDLTrês alelos do gene APOE: ε2, ε3 e ε4.Indivíduos com uma cópia do alelo ε4: risco 2X a 3X de desenvolver Alzheimer tardia.Homozigotos ε4ε4: risco 6X
  30. 30. 2. GENÉTICA HUMANA• TESTES MAIS COMUNS: – Trombofilia hereditária (trombose) – X Frágil (retardo mental) – Microdeleção do Y (infertilidade masculina)
  31. 31. 3. CÂNCERCARCINOMA MEDULAR DA TIREÓIDE– Detecção de mutações no proto- oncogene RET (regulam o ciclo celular) em uma criança com histórico familiar– Permite a tireoidectomia profilática– Elimina o risco de câncer tireoidiano que pode ser fatal.
  32. 32. 3. CÂNCERPOLIPOSE ADENOMATOSA FAMILIAR– Mutações no gene APC determinam elevadíssimo risco de desenvolvimento de tumores colorretais malignos.– Testes deste gene indicarão: • quais indivíduos da família necessitarão de monitoragem • quais não terão de se preocupar
  33. 33. 3. CÂNCER Câncer de mama Mãe BRCA1 mutante Filha50% Gene mutante 50% Gene normal 85% de risco 10% de risco
  34. 34. 3. CÂNCERLEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA Proteína quimérica ABL  Atividade tirosina quinase
  35. 35. 3. CÂNCER LLC• Identificação de pacientes com pior prognóstico. – Portadores de translocação do braço longo do 13 - confere prognóstico favorável e sobrevida de 11 anos – Alterações envolvendo braço longo do 11 – confere sobrevida de 6,6 anos – Portadores de deleção do braço curto do 17 - sobrevida de 2,5 anos
  36. 36. VANTAGENS E DESVANTAGENSDO DIAGNÓSTICO MOLECULAR
  37. 37. VANTAGENS1. BAIXA CONCENTRAÇÃO DO AGENTEIdentifica, caracteriza e quantificaconcentrações extremamente pequenas deDNA/RNA de organismos patogênicos.
  38. 38. VANTAGENS2. VERSATILIDADE DE AMOSTRAS:• Sangue periférico• Fluidos corporais (Líquor, derrame pleural, líquido pericárdico)• Materiais obtidos através de punção (Medula óssea)• Tecidos frescos• Tecidos embebidos em parafina.
  39. 39. VANTAGENS3. VIABILIDADE DO MICROORGANISMO – MOMENTO DA COLETA • INÍCIO DA INFECÇÃO • FASE CRÔNICA
  40. 40. VANTAGENS3. VIABILIDADE DO MICROORGANISMO – CONSERVAÇÃO E TRANSPORTE• Material conservado - Temperatura ambiente• Sob refrigeração (gelo seco ou reciclável)
  41. 41. VANTAGENS4. TEMPO CURTO DE CRESCIMENTO DE MICROORGANISMOS – GENOTIPAGEM – DIAGNÓSTICO RÁPIDO – VERIFICAÇÃO DE RESISTÊNCIA A DROGAS
  42. 42. VANTAGENS5. Alta especificidade6. Diagnóstico rápido, abreviando e otimizando o tratamento.7. Diagnóstico qualificado com aprimoramento no manejo dadoença.8. Diagnóstico confiável9. Diagnóstico com melhor reproducibilidade de resultados.
  43. 43. DESVANTAGENS– CONTAMINAÇÃO DA AMOSTRA– PRESENÇA DE INIBIDORES– VIABILIDADE DOS AGENTES RNA: RNAse– CUSTO– PADRONIZAÇÃO
  44. 44. TÉCNICAS MOLECULARES
  45. 45. TÉCNICAS MOLELCULARES1. Southern blot2. Hibridização in situ3. RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)4. PCR5. Fingerprinting6. Eletroforese em campo pulsado (PFGE)7. Microarranjos8. Sequenciamento
  46. 46. 1. SOUTHERN BLOT• Emprega sondas de DNA com homologia à sequência do DNA-alvo em estudo.
  47. 47. HIBRIDIZAÇÃO IN SITU• Baseia-se no emparelhamento de 2 sequencias de DNA e uma RNA marcada com Digoxigenina.• Permite a visualização de uma sequência nucleotídica especifica em células e tecidos.
  48. 48. 2. HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
  49. 49. Passos da Hibridação in situ1. Coleta do material biológico2. Fixação e desidratação3. Hibridação4. Detecção da sonda por imunohistoquímica5. Revelação com um substrato de fosfatase alcalina
  50. 50. SONDA
  51. 51. 3. RFLP• RFLP - Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição.• Mutações podem alterar o DNA entre um sítio de clivagem e outro.• Isto gera diferentes formas (polimorfismos) do mesmo trecho de DNA.
  52. 52. 3. RFLP• Raia 1: pessoa normal - dois fragmentos (alelos) do mesmo tamanho.• Raia 2: Portador - um alelo sadio e o outro com a mutação.• Raia 3: possui os dois alelos mutados.
  53. 53. 4. PCR• PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)• É uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA,• Objetivo: tornar a sequencia de DNA abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular.
  54. 54. PCR Ciclos• Desnaturação: 94°- 95°C• Anelamento: 55°- 65°C• Extensão: 72°• Número de ciclos: 25-40
  55. 55. PCR - DesnaturaçãoA desnaturação é o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA são separadas através de aquecimento a 95°C.
  56. 56. PCR - AnelamentoO anelamento é o processo através do qual duas sequencias de nucleotídeos são ligadas através da formação de pontes de hidrogênio. Na reação de PCR, o anelamento se dá através da ligação dos primers com o DNA Alvo, a temperatura de 55°C.
  57. 57. PCR PrimersOs primers são sequências de 15 a 30 nucleotídeos, fita única, que são usadas para flanquearem as extremidades da região a ser amplificada. Marcam o início e o fim da sequência-alvo.
  58. 58. PCR Taq DNA PolimeraseAmplifica o DNA a partir do anelamento com os primers, na presença de Mg, a altas temperaturas.
  59. 59. PCR Ciclos
  60. 60. PCR Requerimentos• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM• Tampão: pH 8.3-8.8• dNTPs: 20-200µM• Primers: 0.1-0.5µM• DNA Polimerase: 1-2.5 units• DNA Alvo:  1 µg
  61. 61. Variações da PCR a. RT-PCR, b. nested PCR, c. multiplex PCR, d. RAPD-PCR e. PCR real time. µmicra
  62. 62. RT-PCR• Utiliza uma enzima chamada transcriptase reversa para converter uma amostra de RNA em cDNA .• Antes da etapa de amplificação por PCR,• Permitindo estudo de vírus de RNA e análises de expressão gênica.
  63. 63. Nested-PCR É uma técnica na qual são realizados diversos ciclos de amplificação com um grupo de primers O produto dessa amplificação é re-amplificado, utilizando-se outro grupo de primers dirigidos para uma seqüência que se encontra dentro da seqüência amplificada pelo primeiro grupo de primers. Atualmente, raros são os estudos realizados utilizando esta técnica.
  64. 64. MULTIPLEX PCR• É uma reação de amplificação• Detecta múltiplas sequências-alvo numa mesma amostra.• Vários pares de primers• Desenvolvida para detecção simultânea de vários patógenos.
  65. 65. Multiplex-PCR• Vantagens : – Diminuição da intensidade e do período de trabalho laboratorial – Redução do número de reagentes – Redução dos custos
  66. 66. Multiplex-PCR• Desvantagens desta técnica em relação ao PCR: – Redução da sensibilidade de detecção
  67. 67. RAPD-PCR “Random Amplified Polymorphic DNA” Primer único e pequeno (usualmente de 10 a 15 bases), aleatório Amplificação do DNA genômico em condições de baixa estringência Não sendo necessário o conhecimento prévio da região de ligação do primer.
  68. 68. RAPD-PCR• Quando submetidos à PCR, estes iniciadores arbitrários resultarão na amplificação de uma ou mais seqüências de DNA• Gerando conjuntos de fragmentos que funcionam como marcadores genéticos• O número e o tamanho destes fragmentos são à base de tipagem de um isolado bacteriano (DESTRO, 1995).
  69. 69. RAPD-PCR• A principal vantagem do RAPD sobre o PCR tradicional é a possibilidade de detectar polimorfismos do DNA sem a necessidade de conhecimento prévio da seqüência de nucleotídeos de um gene relevante ou do DNA alvo (MASLOW et al, 1993).
  70. 70. PCR EM TEMPO REAL• Permite que a amplificação e a detecção ocorram simultaneamente, num sistema fechado,• Termociclador que possua sistema de monitoramento de emissão de fluorescência.• Esta técnica é empregada para quantificação de amostras, como para testes de carga viral e monitoramento de doença residual mínima.
  71. 71. PCR em Tempo Real Possui sistema tubular para detectar o acúmulo de produtos de PCR Composto de um termociclador com câmeras detectoras refrigeradas para detecção de luz fluorescente, em que a ressonância emitida é diretamente proporcional à intensidade de fluorescência e por sua vez ao número de produtos amplificados.
  72. 72. TÉCNICAS PARADIAGNÓSTICO DE MUTAÇÕES• Existem várias técnicas que usam o PCR.• Algumas destas técnicas baseiam-se nas diferenças de mobilidade eletroforética de fragmentos com sequências de DNA selvagens e mutantes.
  73. 73. TÉCNICAS PARADIAGNÓSTICO DE MUTAÇÕES• Existem ainda outras técnicas que se baseiam na clivagem de bases não pareadas em heteroduplexes.• Técnicas que utilizam a detecção de alterações na proteína transcrita por um determinado fragmento de DNA.
  74. 74. APLICAÇÕES DO PCR1. Rápida amplificação de um gene específico ou de umexon de um determinado gene como a primeira etapapara rastreamento de mutações não caracterizadas: – PCR para amplificações de exons específicos do DNA genômico – RT-PCR para análise de transcritos
  75. 75. APLICAÇÕES DO PCR2. Rápida genotipagem de regiões dos genesque são polimórficas: I. Digestão da região polimórfica com enzimas de restrição sítio específica. II. Flanqueamento de primers ao sítio de restrição polimórfico, III. Amplificação da região do polimorfismo
  76. 76. APLICAÇÕES DO PCR3. Diagnóstico de mutações conhecidas atravésda discriminação alélica pelo tamanho• Pequenas deleções ou inserções em alelos podem ser detectadas por PCR.• Exemplo: deleções no alelo mais comum que causa a fibrose cística (DF508)
  77. 77. APLICAÇÕES DO PCR4. Diagnóstico de mutações conhecidas atravésda susceptibilidade a enzima de restrição:• Mutações que mudam um sítio de restrição podem ser detectadas, pela digestão do produto de PCR com a enzima de restrição específica
  78. 78. 5. Fingerprinting• O “fingerprinting” é um método para caracterização e discriminação de microrganismos de origem alimentar (JAY, 2005).• Cada vez mais utilizado para fazer inferências sobre níveis de variação genética dentro e entre populações naturais (LYNCH, 1990);
  79. 79. 6. PFGE• Eletroforese em Gel de Campo Pulsado• Uma das técnicas mais utilizadas para análise epidemiológica da maioria das bactérias patogênicas.• É um método derivado da eletroforese convencional do DNA, em gel de agarose, sendo a principal diferença a mudança repetida da orientação do campo elétrico.
  80. 80. PFGEImagem: http://pcrfilme.vilabol.uol.com.br/
  81. 81. PFGE• Esta mudança provoca o re-arranjo da estrutura conformacional da molécula, permitindo a sua migração no gel.• A técnica de PFGE revelou-se capaz de diferenciar cepas da bactéria obtidas a partir de diferentes municípios.
  82. 82. 7. MICROARRANJOS• São lâminas com uma alta densidade de seqüências de DNA• Permitem estudos de expressão gênica,• Analisa uma grande quantidade de genes ao mesmo tempo, utilizando sondas de cDNA.
  83. 83. 8. SEQUENCIAMENTO• Detecta mutações em genes conhecidos.• Permite analisar cada uma das bases de determinada sequência de DNA.
  84. 84. 8. SEQUENCIAMENTO Uso de algumas técnicas que buscam alterações Após a identificação da região gênica que apresenta alguma alteração  Tal região é submetida ao sequenciamento para confirmação e determinação da mutação.
  85. 85. CONSIDERAÇÕES FINAIS• Possibilitou uma grande evolução nas análises de rotina de laboratórios clínicos e industriais.• Organismos de cultivo difícil ou impossível tornaram-se passíveis de serem analisados.• Exames citogenéticos convencionais estão sendo substituídos pela ferramenta molecular.• Determinação de predisposição para certos tipos de câncer e doenças cardiovasculares têm se tornado realidade.• Revolucionou a ciência e a prática da medicina e áreas correlatas
  86. 86. DESAFIOS• Tornar as variadas técnicas de biologia molecular, uma alternativa viável à rotina laboratorial, principalmente em relação ao custo e recursos humanos.
  87. 87. HISTÓRICO DA BIOLOGIAMOLECULAR
  88. 88. 1953Watson e Crick propuseram a estrutura de dupla-hélice do DNA 1957 Arthur Kornberg isolou a DNA polimerase 1958 Matthew Meselson & Franklin Stahl: Replicação semi-conservativa do DNA
  89. 89. 1975 Fred Sanger: Seqüenciamento de DNA baseado em terminação de cadeia por incorporação de ddNTPs 1971David Baltimore & Howard Temin demonstram a presença da RT em víruscapaz de sintetizar DNAfd a partir de RNAfs 1985 Kary Mullis: Permite obter (in vitro) grandes quantidades de uma sequência específica de DNA
  90. 90. 1989 Descoberta da Taq 2000 polimerase Rascunho do Genoma Humano termoestável no lago do “Yellowstone National Park” 1995 Haemophilus influenzae: primeiro genoma1998 seqüenciadoC. elegans: Primeiro genoma completo de um animal Imagens: Paola Cardarelli - XVI ENAAL
  91. 91. OBRIGADO!

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