O documento descreve as endonucleases de restrição, enzimas produzidas por bactérias que cortam o DNA viral em fragmentos para proteger a bactéria contra infecções. As enzimas reconhecem sequências específicas de DNA e geram fragmentos com extremidades que podem ser usados em técnicas moleculares. As enzimas de restrição são amplamente utilizadas em biologia molecular para estudar variações genéticas e construir DNA recombinante.

1. ENDONUCLEASES DE
RESTRIÇÃO

2. A DESCOBERTA
• 1970- Universidade John Hopkins- EUA
• Laboratório de Hamilton Smith
• Isolada enzima de restrição de uma
bactéria
• BACTÉRIAS- produzem naturalmente
enzimas de restrição proteção contra
infecções virais
• Enzimas CORTAM o DNA viral em
fragmentos

3. PORQUE ESTAS ENZIMAS NÃO
DEGRADAM O DNA DAS BACTÉRIAS?
Elas se
protegem
metilando as
sequências de
seu DNA

4. Enzimas de restrição
Enzimas produzidos por bactérias para restringir a proliferação de
vírus invasores
Diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequências de
bases de DNA
Ajuda a detectar a presença de diferentes formas de
determinados genes
in 1fiuA-1crf_-active

5. Nomenclatura
As enzimas de restrição são chamadas de acordo com a
bactéria que o produziu
RY 13
Exemplo: EcoR I
Escherichia coli 1º enzima a ser
descoberta nesta
bactéria
Género
Estirpe Espécie
Ordem de
descoberta

6. COMO ELAS CORTAM O DNA
DOIS TIPOS DE FRAGMENTOS:
- EXTREMIDADES SIMÉTRICAS: quando
as fitas são clivadas em posições opostas
- EXTREMIDADES COESIVAS: quando os
cortes encontram-se deslocados

7. COMO AS ENZIMAS AGEM
Extremidades coesivas

8. EXTREMIDADES SIMÉTRICAS

9. • EcoRI Escherichia coli
• BamHI Bacillus amyloliquefaciens RH
• BglII Bacillus globigii
• PvuII Proteus vulgaris
• HindIII Haemophilus influenzae Rd
• HinfI Haemophilus influenzae Rf
• Sau3A Staphylococcus aureus
• AluI Arthrobacter luteus
• TaqI Thermus aquaticus
• HaeIII Haemophilus aegyptius
• NotI Nocardia otitidis-caviarum

10. Hidrólise Enzimática
- A hidrólise dá-se ao nível
das ligações
fosfodiéster
-Mg2+ é um cofator
essencial, mas pode
ser substituído por
certos cations
divalentes, como Mn2+
- Produtos da hidrólise
resultam em
extremidades 3’-OH e
5’-P
5’
3’
5’
3’

11. Hidrólise Enzimática
A hidrólise enzimática pode ser simples ou múltipla dependendo do
número de enzimas utilizados na obtenção de fragmentos de DNA
 Hidrólise múltipla:
 DNA hidrolisado por mais que um enzima de restrição
 Determinação das posições dos fragmentos no DNA,
produzidos pelos enzimas, com a ajuda da electroforese
 Hidrólise simples:
 Digestão do DNA com um único enzima de restrição
 Determinação relativa das orientações dos fragmentos
no DNA linear

12. Fatores que influenciam a atividade
dos enzimas de restrição:
Composição do tampão
 Diferem na força iónica (concentração de sal)
 Diferem no tampão principal (Na+ ou K+)
 Solução: Manter o pH da reação (geralmente em 8.0)
Influência da metilação no DNA
 Existem algumas endonucleases de restrição que não clivam DNA metilado
Temperatura de incubação
 A maioria dos enzimas cliva melhor a 37ºC
 Exceções: Bactérias termofílicas – clivam melhor entre 50 a 60ºC
Armazenamento: - 20ºC.

13. Como as enzimas de restrição possuem a capacidade
de cortar o DNA dependendo de uma sequência
específica, elas são muito utilizadas em Biologia
Molecular para verificar a variabilidade de indivíduos que
diferem em uma determinada sequência por um único
nucleotídeo (SNP), e para obtenção de fragmentos para
construção de moléculas de DNA recombinante.
UTILIDADE DAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

14. RFPL: Polimorfismos de tamanho do
fragmento de restrição
Técnica utilizada para detecção dos polimorfismos de
um único nucleotídeo (SNPs – single nucleotide
polymorphisms).
Basicamente é um ensaio onde o produto da PCR é
submetido à ação da enzima de restrição.
PCR-RFLP

16. Neste exemplo, em uma população, os indivíduos diferem em uma
determinada sequência do DNA. A grande parte da população possui uma
Adenina na posição 5 da sequência, enquanto a menor parte possui uma
forma variante deste fragmento, cujo na posição 5 existe uma Guanina.

17. Mas como a enzima de restrição pode distinguir qual
indivíduo possui qual sequência ?

18. Clivagem por endonucleases
Aqui existem duas possibilidades de sequência
AGCT ou ACCT, sendo que
a enzima, reconhece

19. Genótipos Possíveis
10
25
50
80
100
70
1 2 3
1 – Indivíduo Heterozigoto: Uma fita
de DNA possui a sequência
reconhecida pela enzima de
restrição, sendo que a outra fita não
possui essa sequência.
2 – Indivíduo homozigoto para o
sítio de restrição. Ambas as fitas
possuem a mesma sequência, que é
reconhecida pela enzima de
restrição.
3 – Indivíduo Homozigoto SEM o
sítio de restrição. Ambas as fitas
possuem a mesma sequência, que
NÂO são reconhecidas pela enzima
de restrição.

20. o gene XRCC1 -
Na posição, Arg399Gln
No DNA correspondente podemos ter os nucleotídeos G ou A .
Um fragmento de 614 pb contendo esta região é amplificado por PCR
e submetido à digestão enzimática.
EXEMPLO
Será utilizada a Enzima MspI – Moxarella species que reconhece CCGG
– A pergunta é: a enzima corta quem ? O Alelo A ou o Alelo G.
Resposta:
614 – alelo A – Não corta pois a enzima não reconhece CCAG
374 e 240 – alelo G

21. AG GG AA
L
GG GG GG GG GG
AG AG AG GG AG
L AG AG AG