O DNA é a biomolécula que possui toda a informação genética, permitindo saber qual o grau de afinidade entre indivíduos.

1. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
GENÉTICA
MOLECULAR E
BIOTECNOLOGIA
RELATÓRIO EXTRACÇÃO E
QUANTIFICAÇÃO DE DNA
Docente: Paula Lopes
Discentes:
CRISTIANA VALENTE Nº 33708;
DAVID RODRIGUES Nº 33714;
FRANCISCO PINTO Nº 33707;
LUÍS SAMPAIO Nº 33706;
PEDRO VEIGA Nº 33698

2. Índice
Introdução ..................................................................................................................................... 3
Objectivos .................................................................................................................................... 4
Resultados ..................................................................................................................................... 4
Discussão ....................................................................................................................................... 5
Conclusão ...................................................................................................................................... 6
Bibliografia .................................................................................................................................... 6
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3. Introdução
O DNA é a biomolécula que possui toda a informação genética, permitindo
saber qual o grau de afinidade entre indivíduos.
O isolamento de DNA de plantas e de material vegetal proveniente de cultura
de tecidos é uma etapa importante na análise da estrutura e organização do genoma
de plantas. É necessário extrair o DNA intacto para não quebrar as ligações, já que
são estas as responsáveis pela informação genética. Qualquer que seja a técnica a
utilizar esta exige a extracção de DNA de boa qualidade, a sua quantificação e
conservação. Para estudar DNA é necessário remove-lo do núcleo da célula. Neste
trabalho estudamos o material genético de células vegetais, apesar da constituição da
sua parede celular, rica em celulose, quitina, outros polissacáridos e fenóis que
dificultam a extracção.
O DNA extraído proveio de folhas de plantas de várias espécies: cevada dos
ratos, cebola, cebolinho e alface.
O método de extracção de DNA utilizado (DNeasyTM Plant Mini Kit-QIAGEN)
consiste em:
1- Macerar 100 mg de tecido, em azoto líquido, até ficar reduzido a um pó
muito fino. Colocar num tubo de 2 mL.
2- Adicionar 400 μL de tampão AP1 e 4 μL de RNAse. Agitar vigorosamente no
vortex.
3- Incubar a mistura 10 min a 65º C. Misturar por inversão 2 a 3 vezes durante
o tempo de incubação.
4- Adicionar 130 μL de tampão AP2, misturar, e incubar 5 minutos em gelo.
5- Centrifugar 5 minutos na velocidade máxima.
6- Aplicar a fase líquida à coluna QIAshredder (Lilás) colocada num tubo de 2
mL e centrifugar 2 minutos na velocidade máxima.
7- Transferir a fase líquida, obtida no passo anterior, para um novo tubo (não
fornecido) sem tocar no “pellet”.
8- Adicionar 0,5 do volume (obtido em 7) de AP3 e 1 volume de etanol (96–
100%) ao lisado e misturar com a pipeta.
9- Colocar 650 μL da mistura obtida em 8, incluindo algum precipitado formado;
à coluna Dneasy colocada num tubo de 2 mL. Centrifugar 1 minuto a 8000 rpm e
eliminar a fase líquida obtida.
10- Repetir o passo 9, utilizando a amostra restante, e eliminar a fase líquida
conjuntamente com o tubo.
11- Colocar a coluna num novo tubo (fornecido), adicionar 500 μL de tampão
AW à coluna e centrifugar 1 min a 8000 rpm. Eliminar a fase líquida e reutilizar o tubo.
12- Repete-se o passo 11 mas com uma centrifugação de 2 min na velocidade
máxima para secar a membrana.
13- Transfere-se a coluna para um tubo de 2 mL e coloca-se 100 μL de tampão
AE previamente aquecido a 65ºC directamente na membrana. Incubar 5 min à
temperatura ambiente e centrifugar 1 min a 8000 rpm para diluir.
14- Repete-se a diluição (passo 13) utilizando o mesmo tubo.
Para quantificar DNA recorremos a dois métodos:
3

4. 
- Quantificação de DNA por espectrofotometria – as medições efectuadas
para a absorvância foram feitas a 260 nm e a 280 nm, sendo que a razão entre
as absorvâncias 260/280 nm determinam a pureza das amostras de ácidos
nucleicos.

- Quantificação de DNA em géis de agarose – o gel de agarose obtém-se
por solidificação da agarose fundida em tampão TBE 1x ao qual se adiciona,
depois de arrefecido, brometo de etídio. Previamente à aplicação no gel,
adicionou-se às amostras tampão de amostra (50% de glicerol, 0,25% de azul
de bromofenol e 1mM EDTA) que facilita a aplicação e visualização destas.
Após a corrida, o gel foi visualizado com radiação UV e fotografado.
Para além dos problemas referidos anteriormente, existem outros problemas durante o
isolamento do DNA:
 Contaminação por fenóis – isto pode se expressar pela coloração marron ou
muito escura do DNA;
 Contaminação por polossacáridos – a amostra de DNA surge com um aspecto
gelatinoso e excesivamente viscoso;
 DNA degradado – isto pode ocorrer pela contaminação das DNAses, por
quebra mecânica durante a extracção com clorofórmico ou por contaminação
com RNA. É visível pelo DNA apresentar um arraste vertical no gel.
Objectivos


Extracção e quantificação de DNA de diversas espécies vegetais;
Testar métodos de forma a compreender quais os mais correctos para cada
espécie;
Resultados
Tabela 1 – Quantificação de DNA por espectofotometria.
Amostra
A (260 nm)
A(280 nm)
R (260/280)
[
] ng/ ml
Cevada rato
(2ª dil.)
0.039
0,03
1,311
39
Cebola (2ª dil.)
Cebolinho
(2ª dil.)
0,046
0,058
0,029
0,036
1,577
1,610
46
58
Alface (2ª dil.)
Cevada rato
(1ª dil.)
0,089
0,123
0,063
0,073
1,422
1,692
89
123
Cebola (1ª dil.)
Cebolinho
(1ª dil.)
0,104
0,060
0,069
0,044
1,509
1,368
104
60
Alface (1ª dil.)
0,306
0,215
1,421
306
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5. Fórmula para calcular a concentração de DNA:
[DNA] g/ml = Razão de diluição x A260 x 50
Fig. 1 – Visualização do gel com as amostras utilizadas.
Discussão
No que refere a razão das absorvâncias, podemos inferir que para as amostras
de razão superior a 2.0 ocorreu contaminação com RNA; por sua vez para valores de
razão inferiores a 1.8 ocorreu contaminação com proteínas.
Da análise dos dados obtidos por espectofotometria conseguimos ordenar as
amostras por ordem crescente de grau de pureza (dado pela razãoA260/A280) da
seguinte forma:
• Cevada dos ratos 2ª diluição <Cebolinho 1ª diluição <Alface 1ª diluição
<Alface 2ª diluição <Cebola 1ª diluição <Cebola 2ª diluição <Cebolinho 2ª diluição
<Cevada dos ratos 1ª diluição
As amostras mais puras são aquelas que apresentam um grau de pureza perto
de 1,8, segundo a Tabela 1.
Todas as amostras apresentam valores abaixo de 1,8 o que nos indica por
esse método que as nossas amostras estão contaminadas por proteínas.
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6. Pela observação da figura 1, verificamos que não está presente nenhuma
banda sobre as amostras, logo não há contaminação por RNA.
Podemos observar que as bandas 1, 2, 5, 6, 9 e 10 apresentam arrastamento,
indicando que o DNA se encontra fragmentado. Por outro lado, as bandas que não
apresentam arrastamento indicam que o DNA está intacto.
Podemos observar que a sequência de amostras do gel de agarose não
corresponde à sequência utilizada na espectrofotometria, uma vez que as as bandas
que supostamente deviam sofrer arrastamento não sofrem.
Conclusão
Podemos concluir que os nossos objectivos não foram atingidos, uma vez que
nenhuma das amostras apresentou o grau de pureza (1,8), sendo o valor mais
próximo 1,692 para a cevada dos ratos 1ª diluição. Concluímos também que todas as
amostras estão contaminadas com proteínas.
Os resultados que obtivemos , nos dois métodos, não coincidem. Pelo que
podemos concluir que, houve erros humanos durante a realização do trabalho.
Provavelmente durante o carregamento das amostras, pequenas quantidades destas
podem ter ficado em suspensão ou retidas na micropipeta. Uma outra hipotese é ter
sido trocada a ordem das amostras.
Podemos concluir que é necessário cruzar os resultados dos dois métodos
para retirar ilações. Uma vez que só possuímos dados viáveis do primeiro método,
não podemos retirar conclusões válidas.
Bibliografia
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
http://www.uefs.br/disciplinas/bot859/extra.pdf
http://www.fc.up.pt/pessoas/aseneca/Teresa%20Azevedo%20Tese.pdf
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