Citotoxicidade

5.165 visualizações

Publicada em

0 comentários
1 gostou
Estatísticas
Notas
  • Seja o primeiro a comentar

Sem downloads
Visualizações
Visualizações totais
5.165
No SlideShare
0
A partir de incorporações
0
Número de incorporações
4
Ações
Compartilhamentos
0
Downloads
108
Comentários
0
Gostaram
1
Incorporações 0
Nenhuma incorporação

Nenhuma nota no slide

Citotoxicidade

  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA DISCIPLINA DE ENGENHARIA TECIDUAL PROFESSORA FERNANDA NEDEL Carolina Ximendes Caroline Lucas 25 de Abril de 2011 Nanomateriais e cultivo celular 1
  2. 2. NANOMATERIAIS  Potenciais efeitos adversos na saúde humana  Testes de toxicidade  Material é colocado em contato com a cultura  Busca de alterações celulares por diferentes mecanismos 2 Introdução
  3. 3. CULTIVO CELULAR 3 Introdução Células epiteliais Células mesoteliais Confluência de 80-90%
  4. 4. 4 Introdução
  5. 5. ENSAIOS IN VITRO  Citotoxicidade  Proliferação celular  Genotoxicidade  Expressão gênica 5 Introdução
  6. 6. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE  Detectar o potencial de um material em produzir efeitos letais ou subletais  Importante no desenvolvimento de produtos para uso em humanos e animais  Aplicado à biomateriais  Liberação de substâncias tóxicas  Lesão celular ou redução da taxa de crescimento 6
  7. 7. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE  Teste de exclusão de Trypan Blue  Microcultura de tetrazólio  Ensaio da Lactato Desidrogenase 7
  8. 8. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE Teste de exclusão de Trypan Blue 8 Controle Identifica o número de células viáveis
  9. 9. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE Teste de exclusão de Trypan Blue 9 Nanopartículas Tipo celular Resultado Amianto crocidolita Células mesoteliais Citotóxico PLA para entrega de genes Células epiteliais Não citotóxico (até 4mg/mL) Diferentes metais e nanotubos de carbono Células do pulmão CuO - Citotóxico Ferro - Pouca toxicidade NTCs - Citotóxicos Hillegas et al; Bejjani et al; Karlsson et al
  10. 10. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE Microcultura de tetrazólio (MTT)  Ensaio metabólico colorimétrico  MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide]  Enzima desidrogenase 10
  11. 11. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE Microcultura de tetrazólio (MTT) 11 Adição do tetrazólio Controle: Cultivo + tetrazólio
  12. 12. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE Microcultura de tetrazólio (MTT) 12 Nanopartículas Tipo celular Resultado Nanopartícula para entrega de fármaco Células mesoteliais Aumento da citotoxicidade PLGA + Paclitaxel Células do pulmão Diminuição da viabilidade celular Hillegas et al; Fonseca et al
  13. 13. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE Lactato desidrogenase (LDH)  Enzima citosólica  Indicadora de morte celular  Integridade da membrana 13
  14. 14. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE Lactato desidrogenase (LDH) 14 Nanopartículas Tipo celular Resultado Albumina e polialquilcianoacrilato Células de pulmão Albumina – Não apresentou aumento de LDH Polialquil – Aumento de LDH Diferentes metais Células do fígado Diâmetro maior – Mais liberação de LDH Brzoska et al; Hussain et al
  15. 15. AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR  Ensaios para avaliar a multiplicação celular  Métodos histoquímicos e imunohistoquímicos 15
  16. 16. AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR  Conteúdo de DNA  Incorporação de timidina  Ki-67  Detecção por PCNA 16
  17. 17. AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR Conteúdo de DNA  Observação e contagem de células em mitose  Quantificar e identificar agentes inibidores ou indutores  Resultado: divisão do número de células em mitose pelo número total de células em uma população 17
  18. 18. AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR Incorporação de timidina  Indicativo do número de células em proliferação  Técnica dispendiosa  Exige treinamento e instalações especiais  Longo período de incubação 18
  19. 19. AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR Antígenos nucleares Ki-67  Presente em todas as fases do ciclo celular PCNA  Associados com síntese e reparação do DNA 19
  20. 20. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE  Nanomateriais com propriedades físico-químicas distintas.  Propriedades de superfície estão diretamente relacionadas com o potencial genotóxico.  Análise dos efeitos diretos no DNA fornecem informações preliminares sobre o potencial de genotoxicidade. 20
  21. 21. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE  Teste de Ames em Salmonella typhimurium e Escherichia coli.  Identificação de mutações no DNA por avaliação da oxidação de guanina  Análise de cariótipos- Ensaio de aberrações cromossômicas e Teste do micronúcleo  Ensaio cometa 21
  22. 22. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE Teste de Ames  Ames e colaboradores desenvolveram uma forma de simular o metabolismo humano no sistema bacteriano.  Realizado em presença ou ausência de sistema de metabolização exógeno (mistura S9).  Incorporação de enzimas do fígado de mamífero no sistema de teste em bactérias. 22
  23. 23. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE Teste de Ames  Ocorrência de uma mutação genética que não causa exigência a um determinado nutriente, que antes era indispensável ao microrganismo.  S. typhimurium- histidina  E. coli- triptofano 23
  24. 24. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE Teste de Ames Salmonella typhimurium 24
  25. 25. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE Teste de Ames Nanopartículas Bactérias Resultado Partículas de UF·TiO2 S. typhimurium cepas TA98, TA100, TA1535, e TA1537 e E. coli cepa WP2uvrA Não mutagênica Fulerenos S. typhimurium strains TA98, TA100, TA1535, e TA1537 e E. coli cepa WP2uvrA Não mutagênica Amianto crocidolita ferro dependente S. typhimurium TA102 Mutagênica 25
  26. 26. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE Teste de Ames  Possíveis diferenças na captação celular das nanopartículas e complexidade genômica entre procariontes e eucariontes.  O ensaio de Ames deve ser complementado por outros estudos. 26
  27. 27. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE Identificação de mutações no DNA por avaliação da oxidação de guanina  Mutações pontuais podem ser identificadas mediante a análise da oxidação de guanina.  Formação de (8-OHdG) e (oxo-dG).  Potencial do nanomaterial para gerar ROS. 27
  28. 28. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE Identificação de mutações no DNA por avaliação da oxidação de guanina Nanopartícula Tipo celular Níveis de (8-OHdG) e (oxo-dG) Liga de cromo-cobalto (∼30 nm) Fibroblastos humanos Não ocorreu aumento de (8-OHdG) Sílica luminescente (∼50 nm) Células de adenocarcinoma de pulmão (A549) Mesmo níveis de (oxo-dG) no grupo exposto e no controle. 28
  29. 29. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE Ensaio de aberrações cromossômicas (CA)  Avalia efeitos no número e na integridade dos cromossomos através da análise de cariótipos.  Técnicas de coloração e microscopia.  Tratamento durante a fase S. 29
  30. 30. AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE Ensaio de aberração cromossômica (CA) Nanopartícula Concentração (μg/mL) CA e aumento no número de cromossomos UF·TiO2 (≤60 nm) 209.7 a 5000 Não UF·TiO2 (∼140 nm) 25 to 2500 Não Fulerenos 5000 5% das células testadas 30
  31. 31. AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE Teste do micronúcleo  Micronúcleos se formam pela extrusão de cromossomos inteiros ou seus fragmentos durante a divisão celular.  Permite identificar eventual aumento na frequência de mutações em células. 31
  32. 32. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE Teste do Micronúcleo Nanopartículas Linhagem celular Formação de micronúcleos UF·TiO2 (≤20 nm) Fibroblastos de embriões de hamster sírio. Aumentou UF·TiO2 (<100 nm) Linfócitos humanos do sangue periférico. Aumentou UF·TiO2 (<100 nm) WIL2-NS Aumentou TiO2, liga cobalto- cromo (∼30 nm) Fibroblastos humanos Aumentou 32
  33. 33. AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE Ensaio Cometa  Identificação de quebras simples e duplas no DNA.  Células com maior quantidade de danos no DNA apresentam migração mais rápida do material genético.  Extensão do dano avaliada pelo deslocamento do material genético (cauda do cometa formada) em relação ao núcleo. 33
  34. 34. AVALIAÇAO DE GENOTOXICIDADE Ensaio cometa 34
  35. 35. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE Ensaio Cometa Nanopartículas Células Tempo de exposição OTM TiO2 (<100 nm) Linfócitos humanos do sangue periférico 0-24 h Aumento dose e tempo dependente UF·TiO2 (<100 nm WIL2-N - Aumento de 5 vezes Fulereno C60 - - Aumentou Liga de cobalto-cromo (∼30 nm) Fibroblastos humanos 24 h Aumentou Silica luminescente (∼50 nm) A549 - Não ocorreu mudança significativa 35
  36. 36. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA Técnicas para avaliação da expressão gênica  Northern blotting  Ensaio de proteção à ribonuclease (RPA)  Ensaios de PCR- RT-PCR e Real-Time PCR  Microarrays 36
  37. 37. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA Northern blotting  Analisa a localização e a quantidade de mRNA.  Compara padrão de expressão gênica entre duas amostras.  Desnaturação do RNA e corrida em gel de agarose.  Trasferência para membrana por ação capilar.  Sondas de RNA ou DNA para hibridizar. 37
  38. 38. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA Ensaio de proteção a ribonuclease (RPA)  Detecta e quantifica transcrições específicas de mRNA. 38
  39. 39. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA Real-time PCR  Método quantitativo para detecção do número de cópias do fragmento alvo.  Quantificação realizada a cada ciclo, baseada na detecção e quantificação de fluorescência emitida durante a reação.  Detecção específica e não específica 39
  40. 40. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA RT-PCR  Reação da transcriptase reversa, seguida pela PCR.  A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar (cDNA).  Amplamente utilizada para verificar a expressão gênica. 40
  41. 41. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA  Microarrays  Arranjo pré-definido de moléculas de DNA quimicamente ligadas à uma superfície sólida.  Detecção e quantificação de ácidos nucleicos (mRNA na forma de cDNA ou DNA genômico) provenientes de amostras biológicas. 41
  42. 42. ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA Ensaio Células Resultado Partícula magnética coberta por ferritina x tratamento sem partícula magnética Fibroblasto Humano Diferença de expressão de 1718 mRNA , genes responsáveis pela organização do citoesqueleto e sinalização celular PLA-PEG Células hepáticas de camundongos Super expressão de transportadores ABC e baixa expressão de Glutationa-S-transferase P1 Inalação de TiO2 - Efisema e indução da expressão de genes relacionados com o ciclo celular, apoptose e expressão de quimiocinas. TiO2 revetido por BSA - Expressão do fator inibidor da migração de macrógafos (MIF) Partículas submicrométricas de titânio - Indução do fator estimulador de colônia de macrófago (M-CSF) em osteoblasto.s Nanopartículas de carbono A549 Aumento da transcrição da heme oxigenase-1 Nanopartículas de cobalto Fibroblastos de camundongos Ativação de vias celulares de defesa e de mecanismos de reparo. 42
  43. 43. CONCLUSÃO  As técnicas podem ser utilizadas para avaliar a toxicidade das nanopartículas, porém um número significativo de falsos sinais positivos são gerados.  Mais de um ensaio e tipo celular devem ser empregados.  Realizar completa caracterização da variação de tamanho, área superficial e composição química dos nanomateriais.  Utilizar novas tecnologias, sistemas e métodos emergentes. 43
  44. 44. REFERÊNCIAS  Jedd M Hillegass, Arti Shukla, Sherrill A Lathrop, Maximilian B MacPherson, Naomi K Fukagawa, Brooke T Mossman. Assessing nanotoxicity in cells in vitro. Wiley interdisciplinary reviews Nanomedicine and nanobiotechnology, 2010.  S.M. Hussain, K.L. Hess, J.M. Gearhart, K.T. Geiss, J.J. Schlager. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells. Elsevier, 2005.  Arora S, Jain J, Rajwade JM, Paknikar KM. Inter- actions of silver nanoparticles with primary mouse fibroblasts and liver cells. Toxicol Appl Pharmacol, 2009. 44
  45. 45. REFERÊNCIAS  Bejjani RA, BenEzra D, Cohen H, Rieger J, Andrieu C, et al. Nanoparticles for gene delivery to retinal pigment epithelial cells. Mol Vis, 2005.  Shukla A, Macpherson MB, Hillegass J, Ramos-Nino ME, Alexeeva V, et al. Alterations in gene expression in human mesothelial cells correlate with mineral pathogenicity. Am J Respir Cell Mol Biol, 2009.  Eva Herzog, Alan Casey, Fiona M. Lyng, Gordon Chambers, Hugh J. Byrne, Maria Davoren. A new approach to the toxicity testing of carbon-based nanomaterials—The clonogenic assay. Elsevier, 2007. 45
  46. 46. OBRIGADA! 46

×