Separação de Aminoácidos por Cromatografia em 4 papel

10.595 visualizações

Publicada em

Publicada em: Saúde e medicina
1 comentário
2 gostaram
Estatísticas
Notas
Sem downloads
Visualizações
Visualizações totais
10.595
No SlideShare
0
A partir de incorporações
0
Número de incorporações
2
Ações
Compartilhamentos
0
Downloads
125
Comentários
1
Gostaram
2
Incorporações 0
Nenhuma incorporação

Nenhuma nota no slide

Separação de Aminoácidos por Cromatografia em 4 papel

  1. 1. EXPERIMENTO 2 - SEPARAÇÃO DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFIA EM 4PAPEL1) OBJETIVOS 1) Analisação cromatográfica de uma mistura de aminoácidos, usando como padrões aminoácidos conhecidos que são aplicados separadamente em papel, onde sua posição é revelada pela reação com ninidrina. 2) Introduzir o conceito de Rf (razão de fluxo) e demonstrar a separação e identificação de aminoácidos através da cromatografia em papel.2) REAGENTES E SOLVENTES Soluções de ninidrina (0,1% em acetona) Mistura desconhecida de aminoácidos Aminoácido desconhecido Soluções-padrão de aminoácidos Mistura de n-butanol: ácido acético: água (4:1:1, v / v / v)3) MATERIAL • Papel Whatman nº1 • Lápis, régua, clip • Béquer (2L) • Placa de Petri • Capilar de vidro4) PROCEDIMENTOS Fazer um traço de lápis ao longo do comprimento maior e a 2cm da bordade uma folha (21x16cm) de papel Whatman nº1, evitando tocar com osdedos o papel durante toda a operação. Marcar 5 pontos sobre o traço quedistem 3cm um do outro e numerá-los a lápis de 1 a 5. Aplicar as amostrasnos pontos numerados com o auxílio de um capilar de vidro, de forma quea mancha sobre o papel tenha o menor diâmetro possível. Nos pontos de 1 a4 aplicar os padrões e no 5 a amostra a ser analisada. Enrolar o papel demodo a transformá-lo num cilindro e prender as extremidades superiores
  2. 2. com a ajuda de um clip. Colocar 25ml do solvente de Patridge (n-butanol:ácido acético: água 4:1:1, v, v, v) em uma placa de Petri e mergulhar ocilindro de papel em seu interior de modo que este fique perfeitamentevertical. Evitar que o papel toque a parede da placa. Cobrir o sistema comum béquer de 2 litros e deixar o solvente migrar cerca de 10cm. Retirar opapel e marcar imediatamente a linha de frente do solvente usando lápis.Secar o papel na capela com o exaustor ligado, mergulhar em solução 0,1%de ninidrina em acetona e levar à estufa (80-100ºC) durante 3 a 4 minutos. Delimitar com lápis as manchas que aparecem no papel.Figura 2.1: Ilustração da parte inicial da experiência (montagem do sistema onde osolvente irá subir ao longo da folha de papel por capilaridade, carregando consigo osaminoácidos depositados previamente e representados por manchas cinzas na figura).
  3. 3. RESULTADOS OBTIDOS Aminoácido Deslocamento do centro imaginário Prolina 2 cm Alanina 1,8 cm Leucina 4 cm Histidina 0,8 cm Mistura 0,8 cm / 1,8 cm / 2 cm / 4 cm Desconhecido 0,8 cmTabela 2.1: Resultado da cromatografia realizada em diversos aminoácidossimultaneamente, sendo que uma solução continha uma mistura de aminoácidos, porisso são apresentados quatro valores (um para cada mancha detectada). Essa misturacontinha prolina, alanina, leucina e histidina. Essa migração dos aminoácidos ocorre devido ao fato de que o solventesobe ao longo do papel por causa da capilaridade e arrasta os aminoácidospreviamente depositados. Caso o solvente seja menos polar que a celulosedo papel, pode-se prever que substâncias pouco polares migrarão mais doque as polares. É justamente esta diferença do comportamento que permiteuma separação eficiente. As posições dos aminoácidos (depois deconcluída a experiência) são reveladas pois eles reagem com a ninidrinaformando compostos que apresentam cor.A tabela abaixo apresenta os valores de Rf calculados e os valores de Rffornecidos para comparação. Os valores de Rf calculados foram obtidosatravés da fórmula Rf = d / Lf onde d é a distância migrada pela substância (as distâncias fornecidas natabela 2.1) e Lf é a distância percorrida pelo solvente. Considerando a retaformada pelos pontos de aplicação dos aminoácidos como o marco 0, ovalor de Lf obtido na experiência foi de 6,5 cm.
  4. 4. Aminoácido Valor de Rf calculado Valor de Rf fornecido Prolina 0,30 0,43 Alanina 0,27 0,38 Leucina 0,61 0,73 Histidina 0,12 0,20 Mistura 0,12 / 0,27 / 0,30 / 0,61 ---- Desconhecido 0,13 ---- Tabela 2.1: Resultado da cromatografia realizada em diversos aminoácidos simultaneamente, sendo que uma solução continha uma mistura de aminoácidos, por isso são apresentados quatro valores (um para cada mancha detectada). Essa mistura continha prolina, alanina, leucina e histidina. A identificação do aminoácido desconhecido aponta para uma forte contradição: enquanto o valor obtido para seu Rf indica que ele é a lisina, a sua distância de migração é praticamente a mesma da histidina. Em compensação, se ao invés de se utilizar o centro hipotético da mancha for utilizado o ponto de maior alcance da mancha, os valores de Rf obtidos possuem grande concordância com os valores fornecidos.Aminoácido Valor de Rf calculado Rf fornecido Ponto máximo da mancha Prolina 0,40 0,43 2,6 cm Alanina 0,38 0,38 2,5 cm Leucina 0,75 0,73 4,9 cm Histidina 0,20 0,20 1,3 cm Mistura 0,2 / 0,38 / 0,40 / 0,75 ---- 1,3 cm / 2,5 cm / 2,6 cm / 4,9 cmDesconhecido 0,21 ---- 1,4 cm Tabela 2.2: Ao invés de ser utilizado o centro hipotético para o cálculo dos valores de Rf os valores acima foram calculados a partir do alcance máximo de cada mancha de cada aminoácido. Observe que a concordância com os valores de Rf fornecidos é grande, o que torna relevante esse fato. Uma possível explicação para o fato de os valores de Rf só terem concordados com os fornecidos é a seguinte: na aplicação dos aminoácidos no papel Whatman nº1 as soluções dos aminoácidos não foram aplicadas de forma a preencher os pontos marcados, ou seja, os aminoácidos acabaram se "espalhando" e, ao migrarem, formaram manchas muito grandes. Isso indica que, se estes aminoácidos tivessem sido aplicados numa região menor, a mancha também seria menor e o centro hipotético acabaria por estar bem próximo do topo da mancha (o topo da mancha é justamente onde estão localizados os aminoácidos que estava no ponto correto no início da experiência). Essa explicação também tem seu valor dado o fato de que os aminoácidos com menores manchas tiveram maior precisão nos valores de Rf calculados, visto que são minimizados erros sistemáticos (imprecisão na demarcação do centro hipotético e medição das distâncias).
  5. 5. Figura 2.2: Reação da ninidrina com a alanina.Figura 2.3: Reação da ninidrina com a histidina.
  6. 6. Figura 2.4: Reação da ninidrina com a leucina. A reação da ninidrina com os aminoácidos primários produz umpigmento púrpura, conforme exibido nas figuras 2.2, 2.3 e 2.4. É a partirdesse pigmento que se torna possível localizar o deslocamento dosaminoácidos na cromatografia em papel. O único aminoácido que éexceção é a prolina que, por possuir um grupo imino ao invés de um grupoamino (tem radical cíclico ligado ao N), forma um composto de coramarela ao invés de púrpura. Por ser mais complexa e diferente, a reação daninidrina com a prolina não está exibida nesse relatório, porém suafórmula estrutural está exibida abaixo: Figura 2.5: Fórmula estrutural da prolina.
  7. 7. Os comportamentos cromatográficos (maior ou menor migração em relaçãoaos padrões) dos aminoácidos estão justificados abaixo: ALANINA A alanina é um aminoácido não polar e alifático. Apesar disso, o seupequeno grupo R (somente um grupo CH3), estando ligado diretamente aocarbono-α, sofre polarizações devido à interação com a parte carregada doaminoácido. Ignorar esse fato acabaria levando à conclusões erradas, ouseja, acabaria levando à idéia de que a alanina iria subir bem mais durante acromatografia. PROLINA A prolina apresenta um comportamento de certa forma análogo ao daalanina, mas isso acontece por ela ter uma cadeia cíclica (ver figura 2.5),onde o carbono-δ está ligado diretamente ao grupo imino (NH2+), sendoque a carga positiva desse também exerce influência sobre tal átomo decarbono. Assim como acontece com a alanina, essa polarização da umaparte da cadeia da prolina acaba gerando interações mais fortes com acelulose (polar), o que faz com que ela suba menos. LEUCINA A leucina é a que tem a cadeia (grupo R) mais apolar de todas, estandoela também no grupo de aminoácidos não polares e alifáticos. Isso justificao fato de ela ter subido mais do que todos os outros aminoácidos eapresentar, portanto, o maior valor de Rf (razão de fluxo). A fórmulaestrutural da leucina está disponibilizada na figura 2.4. HISTIDINA A histidina difere dos três aminoácidos acima pois pertence ao grupo dosaminoácidos com grupo R carregado positivamente. Assim como eraesperado, a sua polaridade evitou que ela subisse tanto durante acromatografia, justamente porque o meio imóvel (celulose) também éapolar (ver estrutura da histidina na figura 2.3).

×