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IFRJ – Campus Maracanã
Coordenadoria de Biotecnologia
Disciplina: Técnicas de Análises Bioquímicas
Turma: BM171
Profes...
Introdução Pág.: 3; 4
Objetivos Pág.: 4
Material Utilizado e Métodos Pág.: 5; 6
Resultados
Discussões
Pág.: 6; 7;
8; 9; 10...
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) – do inglês High-performance
Liquid Cromatography (HPLC) – é o tipo de c...
eficiente da coluna.
A fase estacionária da HPLC é uma resina, que pode ser de três tipos diferentes, e
que se baseiam num...
• Material Utilizado:
▪ Água Milli-Q
▪ Metanol
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▪ Detector Diode Array
• Métodos:
Pesou-se aproximadamente 0,20g de chocolate em pó, em becher de 100mL.
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achocolatado, café solúvel e café descafeinado. Todos os valores a seguir são provenientes
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Ao observar os cromatogramas dos padrões observamos dois picos, eles são
referentes a teobromina e a cafeína, sendo a teob...
Foi possível observar impurezas tanto nas amostras de concentração desconhecidas
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7.7. Referências BibliográficasReferências Bibliográficas
Literatura:
1. SKOOG, D. A. et al. Cromatografia Líquida de Alta...
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  1. 1. ver IFRJ – Campus Maracanã Coordenadoria de Biotecnologia Disciplina: Técnicas de Análises Bioquímicas Turma: BM171 Professores: Hiram Araújo e Leila Pontes Relatório de Técnicas de AnálisesRelatório de Técnicas de Análises BioquímicasBioquímicas HPLC (High-Performance Liquid Cromatography)HPLC (High-Performance Liquid Cromatography) Avaliação: Critério: Nota: Apresentação Introdução Objetivos Material Utilizado/ Métodos Resultados Discussão Conclusão Referências Bibliográficas Total: Alunos: Alexandre G. Garcez Arthur de Lima Bruno Oliveira Rio de Janeiro, 13 de junho de 2011. SumárioSumário
  2. 2. Introdução Pág.: 3; 4 Objetivos Pág.: 4 Material Utilizado e Métodos Pág.: 5; 6 Resultados Discussões Pág.: 6; 7; 8; 9; 10 Conclusão Pág.: 10 Referências Bibliográficas Pág.: 11 Anexo Pág.: 12 1.1. IntroduçãoIntrodução
  3. 3. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) – do inglês High-performance Liquid Cromatography (HPLC) – é o tipo de cromatografia mais utilizado, empregada para separar e determinar as espécies em diversos materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos. Esse tipo de método cromatográfico caracteriza-se pelo aumento do número de pratos teóricos, o que está relacionado com a área da fase estacionária, de modo que quanto menor o tamanho da partícula, maior a resistência ao fluxo da fase móvel. Desta forma, para que haja uma boa resolução, na HPLC são utilizadas partículas de fase estacionária resistentes a altas pressões, constituindo uma estrutura mais complexa e cara (figura 1) se comparada à cromatografia líquida clássica. A partir disso, a cromatografia de alta eficiência pode empregada em cromatografias de adsorção, troca-iônica, partição, afinidade e exclusão. Figura 1: Diagrama esquematizando a instrumentação utilizada na HPLC. Fonte: SKOOG, D. A. et al. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. In: ______. Fundamentos de Química Analítica. 8. ed. São Paulo: Thomson, 2008. p 926. As colunas utilizadas na HPLC são comumente feitas de aço e suportam pressões de até 5,5x107 Pa, tendo de 15 a 50cm de comprimento e de 1 a 4mm de diâmetro, sendo algumas forradas com uma superfície espelhada, que permite um empacotamento mais
  4. 4. eficiente da coluna. A fase estacionária da HPLC é uma resina, que pode ser de três tipos diferentes, e que se baseiam numa estrutura sólida e rígida, diferente das resinas em gel. Já a escolha da fase móvel depende do tipo de separação desejada: separações isocráticas requerem uma única bomba e dois ou mais solventes misturados em proporções fixas; enquanto que nas separações em gradiente, requere-se duas bombas que bombeiam dois solventes diferentes em proporções pré-determinadas. Um dos requisitos com relação à fase móvel na HPLC é que os solventes sejam altamente puros, uma vez que, caso contrário, podem danificar a coluna e interferir no sistema de detecção. As bombas utilizadas na HPLC podem ser de pressão constante, permitindo um fluxo sem pulsos pela coluna, mas que pode reduzir a velocidade deste caso haja uma redução da permeabilidade da coluna, ou também podem ser de troca constante, que mantém sempre o mesmo fluxo através da coluna independente de alterações desta durante a cromatografia. Os detectores mais comuns em HPLC baseiam-se em métodos espectrofotométricos, que lêem absorbâncias tanto no espectro do visível quanto do ultravioleta. Também são utilizados detectores de fluorescência e detectores eletroquímicos, de modo que nos três tipos de detectores a sensibilidade é aumentada após a amostra passar por um processo de derivatização, em que o analito é convertido antes ou após a sua passagem pela coluna em um derivado químico. 2.2. ObjetivosObjetivos • Verificar a presença das metilxantinas, cafeína e a teobromina, em amostra de achocolatado por HPLC com coluna de fase reversa (C18), além de aplicar o método quantitativo de padronização externa para determinar o teor de cafeína. • Discutir a respeito da eficiência e limitações da técnica utilizada. 3.3. Material Utilizado e MétodosMaterial Utilizado e Métodos
  5. 5. • Material Utilizado: ▪ Água Milli-Q ▪ Metanol ▪ Agitador Magnético com aquecimento (Marca: NovaTécnica, Modelo: NTNO3) ▪ Proveta de 100mL ▪ Béquer 50mL ▪ Vidro de relógio ▪ Bastão de vidro ▪ Funil ▪ Papel de Filtro ▪ Balão volumétrico 100mL ▪ Suporte universal ▪ Argola ▪ 2x Pipeta volumétrica de 1mL ▪ Pró pipete ▪ Solução de Carrez I K4[Fe(CN)6] ▪ Solução de Carrez II Zn(C2H3O2)2 ▪ Swinex (25mm / 0,45uL) ▪ Tubo do tipo Eppendorf ▪ Seringa Syringe (1mL) ▪ Seringa ▪ Padrões de concentração TC1, TC2, TC5, TC10, TC20, TC50 em ppm (partes por milhão) ▪ Achocolatado Nescau (0,4998g) (Validade: 01/09/2010) ▪ Café Nescafé Solúvel (Validade: 01/12/2011) ▪ Café Nescafé descafeinado (Validade: 01/02/2011) ▪ Balança Scientech® SA210 ▪ UltiMate® 3000 HPLC focused (Marca: DIONEX) ▪ Coluna cromatográfica C-18 de 100 x 2,1mm com poro de 3µm ▪ Coluna cromatográfica C-18 de 100 x 4,6mm ▪ Detector de UV_VIS
  6. 6. ▪ Detector Diode Array • Métodos: Pesou-se aproximadamente 0,20g de chocolate em pó, em becher de 100mL. Adicionou-se 50 mL de água milli-Q, ferveu-se por aproximadamente 5 minutos e deixou- se em repouso até atingir a temperatura ambiente. Transferiu-se quantativamente a solução resultante para balão volumétrico de 100mL. Adicionou-se 1 mL de cada uma das duas soluções de carrez e após agitação, deixou-se o sistema em repouso por 5 min. Avolumou- se então, até o traço de referência, em seguida filtrou-se, abandonando os primeiros 5 mL. Uma pequena parte de cada uma das soluções finais filtrou-se novamente para tubos eppendorf, usando filtro para amostra aquosa, com 25 mm de diâmetro e 0,45 µm de poro. Com a amostra em mãos deu-se início a cromatografia no aparelho de HPLC. Usou- se os 6 padrões (TC 1, TC 2, TC 5, TC 10, TC 20, TC 50) que já estavam prontos. Antes de injetá-los no aparelho, lavou-se a seringa de vidro com água milli-Q 3 vezes e após rinsou- se novamente por 3 vezes, só que com o padrão que seria injetado, repetindo este procedimento antes de cada injeção. Feito isso, injetou-se cada padrão separadamente esperando-se sempre o tempo de eluição completa de todos os componentes. A quantidade injetada foi superior a 20 µL. Após, colocar-se todas os padrões no aparelho, adicionou-se a amostra, realizando antes a lavagem da seringa 3 vezes com água milli-Q e rinsagem com a própria amostra 3 vezes. Por fim, realizou-se a análise da cromatografia realizada, observando-se as características dos gráficos obtidos. 4.4. ResultadosResultados Nossos resultados desta prática são expressos através de uma tabela adquirida pelo computador acoplado ao HPLC, que nos expressa valores como o tempo de retenção (Ret. Time), a área dos picos do cromatograma (Area), o peso molecular (Height), a concentração (Amount) - além da média destes valores (Average), e o desvio padrão (Rel. Std. Dev.) - das moléculas de cafeína e de teobromina presentes em cada um dos padrões e na amostra de
  7. 7. achocolatado, café solúvel e café descafeinado. Todos os valores a seguir são provenientes de um detector de luz UV/Visível: Cafeína Sample Sample Name Ret.Time (min) Area (mAU*min ) Height (mAU) Amount (µg/mL) Type Plates (EP) 1 TC1 2,067 5,8715 53,1657 1,3234 MB 2816 2 TC2 2,067 10,7175 107,4134 2,4156 bMB 2943 3 TC5 2,06 27,6 270,5283 6,2208 MB 2881 4 TC10 2,06 53,4727 538,1205 12,0522 MB 2990 5 TC20 2,06 102,7172 1047,049 23,1515 MB 3047 6 TC50 2,053 213,7789 2146,645 48,1838 MB 2927 7 Achocolatado 2,06 5,0635 54,265 1,1413 BMb 3142 8 Café solúvel 2,067 47,3775 488,8662 10,6785 BMB 3114 9Ca Café descafeinado 2,067 1,7296 23,6063 0,3898 BMB 4420 Average: 2,061 59,8887 602,4553 13,4984 2964 Rel.Std.Dev: 0,22% 127,42% 127,57% 127,42% 3,64% Teobromina Sample Sample Name Ret.Time (min) Area (mAU*min) Height (mAU) Amount (µg/mL) Type Plates (EP) 1 TC1 1,44 6,3971 64,4558 1,4221 BM 1722 2 TC2 1,44 11,9196 130,7436 2,6497 BMB 1765 3 TC5 1,44 29,6647 326,5343 6,5945 bM 1773 4 TC10 1,44 56,6686 642,9679 12,5975 BM 1848 5 TC20 1,44 108,0406 1236,078 24,0175 BM 1864 6 TC50 1,44 214,482 2396,779 47,6796 M 1765 7 Achocolatado 1,44 56,2543 627,0766 12,5054 MB 1872 8 Café solúvel n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 9 Café descafeinado 1,467 22,7203 293,3458 5,0508 Rd n.a. Average: 1,44 69,061 774,9479 15,3523 1801 Rel.Std.Dev: 0,00% 105,30% 105,40% 105,30% 3,27% As médias dos valores e o desvio padrão apresentados são referentes apenas ao achocolatado, por ser a amostra purificada por nosso grupo. Também é possível observar algumas informações da tabela nos cromatogramas anexados à este relatório. 5.5. DiscussãoDiscussão
  8. 8. Ao observar os cromatogramas dos padrões observamos dois picos, eles são referentes a teobromina e a cafeína, sendo a teobromina presente no chocolate e a cafeína presente no café. Através destes cromatogramas é possível a elaboração de uma curva de calibração com a concentração (em ppm) pelas áreas dos picos, adquiridas pelo aparelho. Com a curva de calibração pudemos encontrar o teor de teobromina e cafeína em outras amostras de concentração desconhecida. Esta curva de calibração está apresentada em anexo, e nela podemos notar uma pequena diferença quanto a concentração prevista pelo HPLC, isto se deve porque a curva de calibração foi realizada por meio das concentrações teóricas do padrão, e elas divergem com as concentrações calculadas pelo aparelho, que é mais preciso. No cromatograma dessas amostras podemos observar que o achocolatado possui dois picos, um maior referente a teobromina, e outra referente a cafeína, que também se apresenta neste em menor quantidade, porém pode aumentar com o tempo de exposição do chocolate ao ambiente, já que por conta de ambos serem alcalóides bem semelhantes da família das metil-xantinas, sob estímulos químicos podem acabar se convertendo, e a cafeína tende a ser um subproduto da teobromina. No café solúvel podemos observar um pico maior que diz respeito a cafeína presente na amostra, e no café descafeinado é possível notar que um dos picos foi identificado como teobromina. Nenhuma das amostras de café possui teobromina, porém no café descafeinado o programa interpretou como sendo este composto por conta do tempo de retenção semelhante desta substância, que provavelmente é uma impureza, já que este tempo foi informado ao aparelho e armazenado em um banco de informações, como sendo específico à teobromina. Também é importante notar que ainda existe, mesmo que em concentrações muito pequenas, resquícios de cafeína na amostra de café descafeinado, pois o processo não apresenta 100% de eficiência. Normalmente é feito dissolvendo-se a cafeína em água e posteriormente utilizando um solvente orgânico como o metileno ou acetato etílico que irá absorver esta cafeína da água, e posteriormente pode ser decantado, e a água evaporada para que o café retorne a forma cristalina.
  9. 9. Foi possível observar impurezas tanto nas amostras de concentração desconhecidas como nos padrões, porém em um aparelho de HPLC isso não será um problema já que uma curva de calibração interna será elaborada com base dos tempos de retenção informados ao aparelho, sendo insensível, portanto, a pequenos ruídos que não deformem os picos das substâncias alvo na purificação. Caso haja deformação a área utilizada para a elaboração da curva pode ser também alterada, por conta disso é bastante importante avaliar os melhores solventes e a melhor proporção entre eles para serem utilizados como fase móvel, também pode-se usar um gradiente de polaridade, caso a forma isocrática não apresente uma qualidade de purificação aceitável, mesmo após a alteração das proporções da fase móvel. Tanto a cafeína quanto a teobromina possuem um caráter predominantemente apolar, porém a cafeína costuma ser mais polar quando está em condições idênticas as submetidas a teobromina, isto se deve por conta da diferença entre as constantes de protonação das duas substâncias. Quanto mais moléculas estiverem protonadas, maior será o caráter apolar desta substância, e conseqüentemente, sob o efeito de uma fase móvel apolar, ela eluirá mais rapidamente, por conta de sua fraca interação com a fase estacionária. Neste ensaio em particular podemos observar que a primeira espécie a eluir é a teobromina, portanto ela possui um caráter apolar mais acentuado nessas condições. O uso de água junto ao metanol aumenta a polaridade da fase móvel, o que é importante, pois caso a força da fase móvel seja muito acentuada muitas espécies podem eluir em conjunto, carreadas facilmente por ela, e independente de suas pequenas diferenças de polaridade acabarão aparecendo no cromatograma em tempos de retenção bem próximos, sendo assim a purificação não teria a eficiência desejada. Uma polaridade muito acentuada faria exatamente o contrário, aumentando muito o tempo de retenção das amostras e isto diminuiria a eficiência do ensaio, pois demoraria mais do que o desejável. É importante também discorrer a respeito da eficiência do HPLC em comparação a outras cromatografias líquidas, o que é possível observar no cromatograma quando observamos a largura da base dos picos. Com o aumento do número de pratos teóricos, por conta da diminuição das partículas utilizadas como fase estacionária, temos maiores “obstáculos” para as substâncias que eluem, desta forma é possível separar substâncias bem semelhantes, como a cafeína e a teobromina utilizadas neste ensaio. Outros fatores como o
  10. 10. diâmetro e tamanho da coluna podem interferir na cromatografia, no nosso caso a coluna utilizada no cromatógrafo com detector UV possui um diâmetro menor, em comparação a que possui um detector Diode Array, e como possuem o mesmo tamanho e mesma fase estacionária, a eficiência de separação é maior no primeiro. O detector Diode Array quando comparado ao detector UV apresenta uma melhor eficiência, tendo uma sensibilidade maior, já que pode mostrar diferentes substâncias no processo de separação que não seriam detectadas no detector UV por não absorverem luz no espectro de onda definido. 6.6. ConclusãoConclusão No HPLC podemos observar uma eficiência muito maior comparado as outras cromatografias líquidas, como discutido isto acontece por conta do aumento de número de pratos teóricos, que independente do caráter da cromatografia (seja de exclusão, adsorção, troca iônica, bioafinidade, etc) irá gerar maiores “obstáculos” ou estabelecer interações mais íntimas com as substâncias eluidas, permitindo portanto a observação de pequenas variações nas características de substâncias distintas, porém semelhantes, sendo possível portanto separações que não eram realizadas em outras cromatografias. No ensaio desta prática foi possível a purificação, e a discussão a respeito dos resultados obtidos, quanto a eficiência e a interpretação dos dados, mostrando inclusive a importância do técnico entender os detalhes do funcionamento do aparelho, para que não chegue a resultados errôneos por conta das informações armazenadas no sistema.
  11. 11. 7.7. Referências BibliográficasReferências Bibliográficas Literatura: 1. SKOOG, D. A. et al. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. In: ______. Fundamentos de Química Analítica. 8. ed. São Paulo: Thomson, 2008. p 924- 945
  12. 12. 0,00 0,13 0,25 0,38 0,50 0,63 0,75 0,88 1,00 1,13 1,25 1,37 1,50 1,62 1,75 1,87 2,00 2,12 2,25 2,37 2,50 2,62 2,75 2,87 3,01 -50 125 250 375 500 625 80007_06_2011_CAFEINA#8 Cafesoluvel UV_VIS_1 mAU min 1-0,2732-0,4203-0,587 4-1,1205-1,213 6-1,473 7-1,9208-Cafeína-2,067 9-2,57310-2,72711-2,893 WVL:272nm 0,00 0,13 0,25 0,38 0,50 0,63 0,75 0,88 1,00 1,13 1,25 1,37 1,50 1,62 1,75 1,87 2,00 2,12 2,25 2,37 2,50 2,62 2,75 2,87 3,00 -200 500 1.000 1.500 2.00007_06_2011_CAFEINA#9 Cafedescafeinado UV_VIS_1 mAU min 1-0,127 2-0,340 3-1,220 4-Teobromina-1,467 5-1,7406-1,9137-Cafeína-2,0678-2,207 9-2,57310-2,72711-2,893 WVL:272nm Anexo (da esquerda para a direita: Achocolatado, Café Solúvel, Café Descafeinado) 0,00 0,13 0,25 0,38 0,50 0,63 0,75 0,88 1,00 1,13 1,25 1,37 1,50 1,62 1,75 1,87 2,00 2,12 2,25 2,37 2,50 2,62 2,75 2,87 3,01 -100 200 400 600 800 1.000 1.20007_06_2011_CAFEINA#7 Achocolatado UV_VIS_1 mAU min 1-0,2932-0,3273-0,5074-0,587 5-1,1136-1,200 7-Teobromina-1,440 8-Cafeína-2,060 9-2,327 10-2,71311-2,880WVL:272nm

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