Aula prática reações qualitativa par aminoácidos e proteínas

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Aula prática reações qualitativa par aminoácidos e proteínas

  1. 1. UFMS LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA AULA PRÁRICA REAÇÕES QUALITATIVAS PARA AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS Profa. Dra. Giovana Cristina Giannesi Objetivo: Identificar e caracterizar diferentes aminoácidos e proteínas através de reações específicas. 1 – REAÇÃO COM BIURETO Fundamento teórico: O Biureto é um reagente analítico, composto de Hidróxido de Sódio (NaOH 2,5N) e sulfato de cobre 1% (CuSO4). A reação do Biureto é detectar a presença de ligações peptídicas, dando positiva para proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação é também positiva para substâncias que contêm 2 carbonilas (-CONH2) ligadas diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio. Os compostos com duas ou mais ligações peptídicas atingem uma coloração violeta quando submetidos a uma solução diluída de sulfato de cobre em meio alcalino. A intensidade da cor varia com a concentração de proteínas. Nesse exercício, o tubo de ensaio com água destilada foi utilizado como tubo controle, uma vez que a água não contém proteínas. Uma ligação peptídica ocorre entre duas moléculas quando o grupo carboxilo de uma molécula reage com o grupo amina de outra molécula, liberando uma molécula de água ( H2O ). Isto é uma reação de síntese por desidratação que ocorre entre moléculas de aminoácidos. Dependendo da complexidade da proteína ou do peptídeo em questão, a cor do produto de reação a presença do Biureto varia substancialmente: proteínas dão coloração violeta, peptídeos dão coloração rosa. Para que a reação ao Biureto seja positiva há necessidade da presença de pelo menos duas ligações peptídicas na molécula, portanto, aminoácidos e dipeptídeos não apresentam reação positiva ao Biureto. O tubo contendo água destilada no qual não ocorreu reação (resultado negativo), serve de referência para os tubos restantes, concluindo-se que os tubos cuja reação foi semelhante à do biureto com a água destilada, e teve resultado final negativo. Por outro lado, nos tubos que ocorreram reações diferentes à da água destilada quando se adicionou biureto, ou seja, apresentara uma coloração violeta ou bem mais escura que o azul pálido apresentado na reação com a água destilada, considerou-se resultado final positivo. Objetivo : Esta prática teve como objetivos detectar a presença de ligações peptídicas. Reativos: Foram utilizados: - Biureto (1mL de NaOH 2,5 + 1mL de Sulfato de Cobre); - água destilada; - leite; - clara de ovo; - glicina ; - triptofano e - albumina.
  2. 2. Técnica : (5 tubos)  Tubo 1: 1mL de água destilada;  Tubo 2: 1mL de glicína 1%;  Tubo 3: 1mL de leite;  Tubo 4: 1mL de clara de ovo;  Tubo 5: 1mL de albumina 1%. Foi adicionado em cada tubo, aproximadamente 1mL do reagente de biureto, agitando-se continuamente. Resultados: Tubo 1: Resultado NEGATIVO  Coloração azul muito pálida.  A água não tem componentes de proteínas em sua composição. Tubo 2: Resultado NEGATIVO  Coloração azul um pouco mais escura que no tubo 1  Glicina é um aminoácido portanto, sem ligações peptídicas. Tubo 3: Resultado POSITIVO  Coloração púrpura.  O leite apresenta várias proteínas em sua composição. Tubo 4: Resultado POSITIVO  Coloração púrpura  A Clara de ovo contém proteínas (albumina, inclusive) que apresentam ligações peptídicas. Tubo 5: Resultado POSITIVO  Coloração púrpura  A albumina é uma proteína cujos aminoácidos formam uma cadeia por ligações peptídicas. 2 – REAÇÃO DE NINHIDRINA Fundamento teórico: A ninhidrina (2,2-diidroxi-hidrindeno-1,3-diona) é um poderoso agente oxidante que reage com grupo de amino livres de aminoácidos, peptídeos e proteínas desde que o pH da solução esteja entre 4 e 8. A reação dos aminoácidos com a ninhidrina origina um composto de cor púrpura de Ruherman no geral, e amarelo para a prolina, não apresentando sempre a mesma intensidade de coloração. A ninhidrina é comumente usada para detectar impressões digitais, já que, graças a sua reação com os aminogrupos terminais das moléculas de lisina incorporadas nas proteínas ou peptídeos, é suficientemente sensível para revelar resíduos de pele. Objetivo : Esta prática teve como objetivos caracterizar a presença de aminas livres. Reativos: Foram utilizados: - Ninhidrina; - leite; - clara de ovo diluída; - albumina 1%; - prolina 1%; - glicina 1%; - fenilanina 1%.
  3. 3. Técnica : (6 tubos) Em cada tubo de ensaio foi pipetado 1mL da solução de ninhidrina e adicionado 1mL de cada um dos reagentes descritos abaixo:  Tubo 1: 1mL de água destilada;  Tubo 2: 1mL de leite;  Tubo 3: 1mL de clara de ovo diluída;  Tubo 4: 1mL de prolina 1%;  Tubo 5: 1mL de glicina 1%;  Tubo 6: 1mL de albumina 1%. Foi adicionado em cada tubo, aproximadamente 1mL do reagente de nihidrina, agitando-se continuamente e fervendo em seguida por alguns minutos em banho-maria, até o aparecimento da cor. Resultados: Tubo 1: Resultado NEGATIVO  A água não apresenta aminoácidos em sua composição. Tubo 2: Resultado POSITIVO  Coloração roxo  O leite apresenta aminas livres em sua composição proteica. Aquecendo-se uma proteína e depois adicionando-se a nihidrina forma-se uma coloração azul por causa da reação desse reagente com os aminoácidos presentes na proteína. Tubo 3: Resultado POSITIVO  Coloração liláz.  Como o leite, a clara de ovo apresenta várias proteínas em sua composição, inclusive albumina. Tubo 4: Resultado POSITIVO  Coloração amarela  A prolina é um dos aminoácidos codificados pelo código genético, sendo portanto um dos componentes das proteínas dos seres vivos. Diferencia-se dos demais aminoácidos devido ao fato de possuir uma estrutura quimicamente coesa e rígida, sendo mesmo o aminoácido mais rígido dos vinte que são codificados geneticamente. A sua estrutura anelar confere-lhe ainda a classificação de iminoácido, já que a sua estrutura resulta da ligação do terminal alfa-amina (NH2) à cadeia variável alifática e forma um produto amarelo na reação com a ninhidrina. Tubo 5: Resultado POSITIVO  Coloração púrpura  A Glicina é um aminoácido portanto apresenta aminas livres. Tubo 6: Resultado POSITIVO  Coloração amarelo escuro  No caso da albumina, que é uma proteína hidrossolúvel do tipo globular cuja função é armazenar nutrientes, não reagiu instantaneamente com a ninhidrina. Sendo a albumina uma proteína, os aminoácidos que a constituem estão unidos por ligações peptídicas e não no estado livre motivo pelo qual não reagiu imediatamente com a ninhidrina, que esta apenas detecta os aminoácidos livres. No entanto, depois de aquecida, a albumina reagiu com a ninhidrina porque suas ligações peptídicas foram quebradas, devido ao aumento da vibração das partículas em consequência do aumento da temperatura, alterando assim a conformação desta proteína, expondo os aminoácidos livres de sua composição à ninhidrina. 3 – REAÇÃO XANTOPROTEICA
  4. 4. Fundamento teórico: As proteínas que possuem grupamento fenil (-C6H5); reagem com HNO3 formando compostos fortemente coloridos. Objetivo : Esta prática teve como objetivos identificar aminoácidos com grupo aromático (cadeias laterai). Bibliografia: - http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100- 46702002000200006&script=sci_abstract&tlng=pt - http://www.nupel.uem.br/pasteurizacao.pdf

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