1. Apresenta os principais conceitos e diferenças entre cromatografia líquida de alta eficiência preparativa e analítica. 2. Discutem-se os parâmetros importantes para o desenvolvimento de métodos preparativos como colunas, fase móvel, detectores e coletor de frações. 3. Aborda-se o processo de scale-up, sobrecarga da coluna e avaliação dos resultados de uma corrida preparativa.

1. Universidade de São Paulo
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto
HPLC PREPARATIVA
Letícia Fracarolli
Disciplina: Atualização em Técnicas de Análise Toxicológica:
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Eletroforese Capilar

2. SUMÁRIO
1. Introdução
1.1. Principais diferenças entre HPLC
analítico e HPLC preparativo
2. Colunas
2.1. Fase estacionária
3. Fase móvel
4. Detectores utilizados em HPLC
preparativo
4.1. Splitter
4.1.1. Calibração do tempo de atraso
5. Coletor de frações
6. Preparação da amostra
7. Desenvolvimento de métodos
6.1. Scale-up
6.1.1. Scale-up otimizado
6.2. Sobrecarga da coluna
8. Sistema Reciclante
9. Avaliação do resultado de
uma corrida preparativa
10. Aplicações
11. Referências

3. 1. INTRODUÇÃO
Cromatografia
Cromatografia
líquida de alta
performance
preparativa
Separação de
misturas por
distribuição em
duas fases móveis
imiscíveis.
É um processo de
purificação que
usa a
cromatografia
líquida.

4. 1. INTRODUÇÃO
Esquema de um HPLC preparativo

5. 1. INTRODUÇÃO

Parâmetros para otimizar o fator de separação e
resolução de picos:

Fase estacionária apropriada;

Fase móvel adequada;

Temperatura.

6. 1.1. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE HPLC
PREPARATIVO E HPLC ANALÍTICO
HPLC
preparativo
Objetivo de isolamento
ou purificação de
substâncias de alto valor.
≠
HPLC
analítico
Objetivo limitado a
determinação qualitativa
e quantitativa de um
composto.

7. 1.1. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE HPLC
PREPARATIVO E HPLC ANALÍTICO
HPLC
preparativo
Quantidades de amostra
maiores (mg).
HPLC
analítico
≠
Quantidades de amostra
menores (µg).
O objetivo de uma
purificação preparativa é a
produção máxima de
produto purificado por
injeção.

8. 2. COLUNAS

O papel da coluna é fundamental no desenvolvimento de
um método;

Capacidade do material de embalagem: visando maior
rendimento, colunas com maior capacidade podem
suportar mais material por injeção.

O custo de colunas preparativas aumenta com o tamanho.

9. 2. COLUNAS

Dimensões da coluna: de acordo com a quantidade de
material que se deseja injetar.
Diâmetro interno da coluna (mm)
Utilidade
4,6
HPLC preparativo em pequena escala
7,8
HPLC semi-preparativo
>21,2
HPLC preparativo em maior escala

10. 2. COLUNAS
http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC

11. 2.1. FASE ESTACIONÁRIA

Componentes rígidos e porosos:
Mais
utilizadas:
Sílica –
C8
Sílica –
C18

12. 2.1. FASE ESTACIONÁRIA

Sua escolha deve ser feita de maneira a proporcionar a
melhor seletividade para os componentes de interesse.

13. 2.1. FASE ESTACIONÁRIA

Tamanho de partícula:
HPLC
preparativo
Partículas de 1,8-3,5 µm não são
utilizadas. As partículas de 5 µm
são as mais utilizadas. Para as
amostras bem resolvidas, são
escolhidas partículas de 7-10 µm.
≠
HPLC
analítico
Quanto menor o tamanho
da partícula maior será a
eficiência.

14. 3. FASE MÓVEL

Podem ser utilizados em modo gradiente ou isocrático.

Alguns fatores que influenciam na escolha do solvente
são os seguintes:

Fase estacionária e condições de fase móvel com melhor
seletividade para compostos de interesse;

Características espectroscópicas do solvente da fase móvel;

15. 3. FASE MÓVEL

Volatilidade para facilitar a remoção a partir da fração
isolada;

Viscosidade;

Pureza;

Boas propriedades de solubilidade para cargas máximas de
amostra;

Custo dos solventes utilizados.

16. 4. DETECTORES UTILIZADOS EM HPLC
PREPARATIVO

Detectores destrutivos:
Detector Eletroquímico.
Espectrômetro
de
Massas,

Detectores não destrutivos: Detectores UV VIS, DAD,
Detector de Índice de Refração, Detector de
Espalhamento de Luz, Detector de Fluorescência.

17. 4. DETECTORES UTILIZADOS EM HPLC
PREPARATIVO

Detectores destrutivos: necessitam de um splitter para
desviar uma pequena parte da amostra para o detector e o
restante para o coletor de frações.

18. 4.1. SPLITTER

Divisor de fluxo tradicional: divisor passivo.

19. 4.1. SPLITTER

Divisor ativo: tem dois caminhos de fluxo separados e
uma válvula de troca rápida, que transfere o composto a
partir do fluxo principal para o fluxo de make-up.

20. 4.1. SPLITTER
Possibilidade de selecionar
diferentes proporções de
divisão, alterando a
frequência de troca da
válvula;
Proporções exatas e
constantes, divisão não é
afetada pela viscosidade,
temperatura e comprimento
da tubulação;
Vantagens do
divisor ativo
Dois caminhos de fluxo
independentes, permitem o
uso de diferentes
modificadores;
Contra-pressão mínima, não
há o perigo de danificar a
célula detectora.

21. 4.1.1 CALIBRAÇÃO DO TEMPO DE ATRASO

A troca da válvula tem de ser atrasada até que o
composto passe da célula detectora para a entrada da
válvula de desvio. Este tempo é chamado de tempo de
delay (tempo de atraso) (TD1) e deve ser determinada de
antemão:
Procedimento de
calibração de
atraso

22. 4.1.1 CALIBRAÇÃO DO TEMPO DE ATRASO
Procedimento de
calibração de
atraso
Usado para determinar o
tempo de atraso entre o
detector e o coletor de
frações.
Injetar um corante concentrado
sobre o sistema e controlar o
sinal do detector no visor online do software de controle.
Começar com um volume de
atraso estimado ou
calculado.

23. 5. COLETOR DE FRAÇÕES
HPLC
preparativo
Amostra vai para o
coletor de frações.
≠
HPLC
analítico
Amostra vai direto
para o descarte.

24. 5. COLETOR DE FRAÇÕES

Disponíveis
Exemplos:
em
diferentes
tamanhos
e
modelos.

Coletor de micro fração: é projetado para vazões abaixo de
100 µL / min;

Coletor de fração em escala analítica: é projetado para vazões
abaixo de 10 mL / min;

Coletor de fração em escala preparativa: é projetado para
vazões de até 100 mL / min.

25. 5. COLETOR DE FRAÇÕES

O coletor de frações desvia o fluxo para um recipiente de
fração através da agulha de coleta de fração.

Utilizando uma válvula de desvio que pode ser ligada, por
exemplo, através de programação de tempo, ou em função de
um sinal do detector.

26. 6. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

A preparação da amostra é de especial atenção ao realizar
HPLC preparativa sobre colunas caras e, embora os
objetivos não são necessariamente os mesmos, muitos
dos procedimentos utilizados são idênticos aos
encontrados em HPLC analítica.
Correta dissolução;
 Filtração de amostra, etc.


27. 7. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS
HPLC
preparativo
Quantidades de amostra
maiores (mg).
1.
2.
Scale-up (ampliação) do
sistema de análise;
Sobrecarga da coluna.
≠
HPLC
analítico
Quantidades de amostra
menores (µg).

28. 7.1. SCALE-UP

Scale-up do sistema de análise: colunas de diâmetro
maior, maior vazão e maior volume da amostra com o
comprimento da coluna e concentração da amostra
permanecendo constante.
Os picos permanecem
nítidos e simétricos.
Uso de colunas grandes e
volumes elevados de
solventes, portanto, o
método não seria
econômico.

29. 7.1. SCALE-UP

Dois parâmetros devem ser ajustados quando se passa de uma
coluna com D.I menor para uma coluna com D.I maior:
Quantidade de amostra aplicada à coluna;
2. Vazão.
1.
Considere uma ampliação de uma coluna de 4,6 × 150 mm para uma de 19 × 150
mm:
Sendo assim, podemos
dizer que pode ser aplicado
aproximadamente 17-135
mg de amostra nesta
coluna preparativa.

30. 7.1. SCALE-UP
Vazão:
Duração do Gradiente:

31. 7.1. SCALE-UP

Carregamento
(massa)
razoável
para
colunas
preparativas de acordo com o tamanho, no modo
gradiente:

32. 7.2. SCALE-UP OTIMIZADO

Otimização e scale-up de uma análise de um método preparativo é feito em
três passos:
Desenvolver e
otimizar a
separação inicial
sobre uma coluna
de tamanho
analítica
• Como
otimizar?
Sobrecarregar a
coluna, mantendo a
separação adequada
de componentes de
interesse
Aumentar a escala de
acordo com uma
coluna preparativa
com base na
quantidade de
composto necessária
para purificar.

33. Coluna: Shim-pack PREPODS(H) Kit
A) 250 mm x 4.6 mm D.I., 5 μm
B) 250 mm x 20 mm D.I., 5 μm
Fase móvel: 0.1% ácido fórmico/
metanol = 1/9 (v/v)
Vazão:
A) 0.8 mL/min
B) 15 mL/min
Temperatura ambiente
Detecção em 254 nm
Picos: 1: Ácido Benzóico
2: 2-naftol
3: Benzeno
4: Naftaleno
5: Bifenilo
6: Fenantreno
7: Antraceno
8: Fluoranteno
Shimadzu Catalogue

34. 7.2. SOBRECARGA DA COLUNA

Aumento da quantidade de amostra aplicada nas mesmas
condições de análise;

Geralmente é o método de escolha;

Permite separar amostras na gama de mg mesmo em
colunas analíticas.

Pode ser feito de duas maneiras:


Sobrecarga de concentração;
Sobrecarga de volume.

35. 7.2. SOBRECARGA DA COLUNA
Sobrecarga de concentração: a concentração da
amostra é aumentada, mas o volume de amostra injetada
permanece o mesmo;
 Sobrecarga de volume: quando o composto tem baixa
solubilidade.

Ambas as técnicas de
sobrecarga são
usadas ​em
combinação.

36. 7.2. SOBRECARGA DA COLUNA

37. 8. SISTEMA RECICLANTE

A reciclagem em circuito fechado é um método de
purificação que melhora a separação;

Reduzir os custos
comprimentos.
com
colunas
de
grandes

38. 8. SISTEMA RECICLANTE

A amostra é reintroduzida na coluna repetidamente, de
modo que é possível acomodar a separação e purificação
de compostos que são normalmente difíceis de separar;

Não há necessidade de ligar um número de colunas em
série, de modo que é possível controlar o custo das
colunas, e reduzir o consumo de solvente utilizado como
fase móvel.

39. 8. SISTEMA RECICLANTE

40. 9. AVALIAÇÃO DO RESULTADO DE UMA CORRIDA
PREPARATIVA:
Três parâmetros importantes: pureza do produto, o
rendimento e produtividade;
 São dependentes uns dos outros, não sendo possível
otimizar um método de HPLC preparativa com respeito a
todos os três parâmetros.


41. 10. APLICAÇÕES

Variam de escala para laboratório até escala industrial:
Separações quirais;
 Purificação de misturas sintéticas complexas;
 Isolamento extrato natural;
 Purificação de peptídeos.


42. 
“Estudos epidemiológicos têm mostrado que o aumento
do consumo de vegetais, como brócolis e couve, pode
reduzir o risco de desenvolvimento de câncer no
pâncreas, pulmão, colo-retal e próstata”.

43. Brassica oleracea var. Italica:
As cultivares de brócolis
brigadeiro foram cultivadas
até a maturidade de colheita
Sementes foram
selecionadas devido ao
alto teor de glicorafanina
Foi injetado 2 mL da
amostra filtrada.
A fase aquosa foi filtrada em
um filtro de membrana de
0,22 µm, e preparada para a
injeção em HPLC.
O resíduo resultante foi
dissolvido em 120 mL
de acetonitrila 5% em
água (v /v) e lavado 3 x
com hexano para
remover o excesso de
contaminantes apolares.
MATERIAIS E
MÉTODOS
A pasta formada foi
extraída 3 x com iguais
volumes de cloreto de
metileno em excesso, a
qual foi combinada e
secou-se a 32 ° C sob
vácuo num evaporador
rotativo.
Foram moídas com
água da torneira.
Desengorduradas 3 x com
excesso de hexano e
deixadas a secar durante a
noite numa coifa.
Os glicosinolatos foram
hidrolisados por adição de água
(03:01 de água/semente
desengordurada), e a
mistura foi deixada em autólise
durante 8 h à temperatura
ambiente.
Foram misturados
cloreto de sódio, a
farinha molhada e
sulfato de sódio
(1:1:0,75).

44. MATERIAIS E MÉTODOS




Coluna: Waters Prep Nova-Pak (19 × 300 mm, 60 Å, 6 µm)
HR C-18 reversed-phase HPLC column (Waters, Milford,
MA);
Vazão: 9 mL/min;
FM: 10 % de acetonitrila em água durante 3 min; mudou
linearmente durante 2 min a 25 % de acetonitrila, e mantidas
isocráticamente durante 15 min. A porcentagem de acetonitrila
foi aumentada para 100% mais de 2 min e seguiu assim,
isocraticamente por 2 min para purgar a coluna.
Detectores: Detector por índice de refração para detectar o
sulforafano nitrila, e a absorvância a 254 nm foi utilizada para
detectar o sulforafano.

45. RESULTADOS E DISCUSSÃO

46. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Rendimento: para cada pico sulforafano rendeu 3,5 mg
de sulforafano purificada, e a fração de eluato
correspondente a cada pico de sulforafano nitrila rendeu
3,3 mg de sulforafano nitrila purificada. Com base nestes
resultados, cada quilograma de semente extraída pode
produzir 4,8 g de sulforafano e 3,8 g de sulforafano
nitrila.

47. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Concluindo: “Existem vários métodos de purificação ou
de síntese. Porém, estes métodos são concebidos apenas
para a produção de quantidades de mg destes compostos,
e não se prevê a produção de larga escala necessária para
estudos extensivos in vivo. Sulforafano está
comercialmente disponível, mas é muito caro, e
Sulforafano nitrila não está comercialmente disponível
no momento. As sementes de vegetais crucíferos
possuem níveis relativamente elevados de glucosinolatos
por grama, reduzindo a quantidade de material de partida
necessário para se obter um extrato aquoso concentrado
adequado para a separação por HPLC.”

48. RESULTADOS E DISCUSSÃO
“Além disso, a utilização de sementes de brócolis
brigadeiro facilitou a extração de grandes quantidades de
sulforafano e sulforafano nitrila, porque verificou-se que
contém níveis elevados de glicorafanina em comparação
com outros cultivares.”
 “Embora não testado no artigo em questão, é provável
que as sementes de outras variedades de brócolis tendo
níveis elevados glicorafanina também proporcionarão
uma boa fonte para purificação de sulforafano e
sulforafano nitrila com o mesmo método.”


49. 11. REFERÊNCIAS

AGILENT TECHNOLOGIES. Principles in preparative HPLC. Agilent Technologies Inc,
Printed in Germany, April 2007.

WELLINGS, D. A. A Practical Handbook of Preparative HPLC. Elsevier, 2006.

KAZAKEVICH, Y.; LOBRUTTO, R. HPLC for pharmaceutical scientists. Wiley, 2007.

MEYER, V. R. Practical High-Performance Liquid Chromatography, fourth edition. Wiley,
2004.

SHIMADZU CATALOGUE. Prominence Preparative HPLC System.

WATERS CATALOGUE. Preparative LC Columns and Consumables.

MATUSHESKI, N. V.; WALLIG M. A.; JUVIK, J. A.; KLEIN, B. P.; KUSHAD, M. M.;
JEFFERY, E. H. Preparative HPLC Method for the Purification of Sulforaphane and
Sulforaphane Nitrile from Brassica oleracea. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 1867-1872.

50. 11. REFERÊNCIAS

How Does High Performance Liquid Chromatography Work? Disponível em:
<http://www.waters.com/waters/pt_BR/How-Does-High-Performance-LiquidChromatography-Work%3F/nav.htm?cid=10049055&locale=pt_BR>
Acessado
em:
10/10/2013.

Scaling Up. Disponível em: <http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/prep/prep3.html>
Acessado em: 10/10/2013.

Recycling
Preparative
HPLC
Instrument.
Disponível
em:
<http://www.columnex.com/chromatography/instruments/prep-hplc-recycling/> Acessado
em: 17/10/2013.

HPLC
preparativo.
Disponível
<https://pt.vwr.com/app/Header?tmpl=/chromatography/preparative_hplc.htm>
em: 17/10/2013.

Phenomenex
Preparative
Columns:
Disponível
<http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC> Acessado em 24/10/2013.
em:
Acessado
em: