Slide sobre Microscopia de luz ultravioleta e fluorescência

1. Microscopia
Ultravioleta
e
Microscopia de
Fluorescência
Alunas: Alessandra, Aline, Isabele, Sara

2. O que é um microscópio?
É uma ferramenta de laboratório, que permite a
visualização de estruturas imperceptíveis ao olho
humano. O tipo de microscopia mais comum é a
óptica ou microscopia de luz.

3. Microscopia Óptica
A microscopia óptica, ou de luz,
possibilita a visualização de
estruturas, através da incidência de
luz sobre a amostra e da ampliação
de lentes: objetivas e oculares. Os
tipos de microscopios ópticos podem
ser: Simples (lupa) e Composto
(campo claro, ultravioleta,
fluorescência, campo escuro,
polarização e contraste de fase).

4. Microscopia ultravioleta
e fluorescência
Nestes dois tipos de microscopia de luz, utiliza se a luz
ultravioleta ao invés de luz branca comum, como fonte de
luz. A luz ultravioleta possui um comprimento de onda
muito menor que a luz branca, o que permite uma
resolução duas vezes melhor que a microscopia comum de
campo claro.

5. Estrutura do Microscópio
Ultravioleta e Fluorescência
 A estrutura do microscópio ultravioleta e
fluorescencia é constituida por:
• Fonte de luz ultravioleta, proveniente da
vaporização do Mercúrio
• Filtros (excitação/ barreira)
• Espelhos dicróicos aluminizados
• Condensador
• Diafragma
• Lentes objetivas e oculares feitas de
quartzo;
• Tubo conversor de imagem,
• Camera fotográfica,
• e Botões de focalização: macro e micrométricos.

6. Luz Ultravioleta
A luz ultravioleta é invisível ao olho
humano, não pode ser captada pela
retina e é prejudicial; impossibilitando-a
de ser observada diretamente, no
entanto existe um processo chamado
fotográfia de fluorescência, no qual a luz
ultravioleta é absorvida pela amostra, e
em seguida filtrada e convertida,
chegando na câmera fotográfica como
luz comum (visível aos olhos humanos)
após isto a imagem é transmitida para
um computador

7. Princípio físico da Microscopia de
Fluorescência
. Excitação Eletrônica

8. Trajetória da luz ultravioleta no
microscópio
O mercúrio quando recebe uma descarga
elétrica emite luz ultravioleta (UV),essa luz
passa sobre um filtro de excitação e
depois incide sobre um espelho dicróico
que reflete a luz ultravioleta (luz azul) até
a amostra, quando chega ate as moleculas
da amostra, a luz ultravioleta excita os
elétrons do material tornando-o luminoso,
em seguida esta luminosidade é coletada
pela objetiva e volta com o comprimento
de onda maior e menos energético,ou seja
como luz visível (verde), passando pelo
espelho dicróico e pelo filtro de barreira
(capaz de eliminar outros comprimentos
de onda de luminosidade prejudiciais ao
olho humano) formando assim a imagem.

9. Fluoróforos
São corantes fluorescentes que quando entram em
Contato com a amostra, e acoplam se nas estruturas
existentes no interior da célula, e emitindo luz visível
quando expostas à luz ultravioleta.

10. Pra que serve esses fluoróforos?
. Os fluoroforos tornam possível a visualização de
pontos específicos da célula
Núcleos corados com reddot (fluoróforo)

11. Como isso ocorre?
Essa técnica de fluorescência
funciona da seguinte maneira, aplica
se fluoróforos na amostra, e estes
ligam se a estruturas presentes no
interior da celula. Quando a amostra
absorve luz ultravioleta os elétrons
destes fluoróforos excitam se,
emitindo fluorescencia
(luminosidade), permitindo assim a
visualização das estruturas
desejadas.
Núcleo de linfócitos humanos
coloridos com DAPI
com o cromossoma 13 (verde)
e 21 (vermelho)

12. Fluorescência Múltipla
Nesta técnica aplica-se tipos diferentes de
fluoróforos separadamente numa mesma amostra
capturando as imagens de forma sequencial, e ao
final deste processo é feita a junção das imagens
através de recursos computadorizados.
Utiliza se fluoróforos específicos para estruturas
especificas da célula, e feixes de luz adequados a
fluoróforos específicos, previamente selecionados no
filtro de excitação

13. Exemplo:
Imagem epifluorescente de
três componentes em uma
divisão de uma célula
cancerosa humana. O DNA está
manchado de azul, uma
proteína chamada INCENP
aparece em verde, os
microtúbulos são vermelhos.
E a imagem final dos três
componentes juntos.

14. Fluorescência natural
A Fluorescência natural ocorre quando a amostra
não necessita de corante para emitir luz após ser
exposta a luz UV. Exemplo: clorofila

15. Aplicações da Microscopia
ultravioleta e Fluorescencia
• É utilizado na investigação científica, para estudo de
evidências.
• Utilizado também no estudo de organelas e estruturas
celulares, reações enzimáticas, eventos fisiológicos e
bioquímicos nas células vivas, análise de viabilidade celular, de
função celular.
• E na imunofluorescência, como a reação de antígenos no
interior celular dentre outros estudos.
•A existência de múltiplos indicadores fluorescentes contribui
para o estudo de uma multiplicidade de produtos químicos
fisiologicamente importantes
como DNA, cálcio, magnésio, sódio, pH e enzimas.