Este documento descreve um projeto de pesquisa que tem como objetivos: 1) analisar a composição química dos óleos essenciais de folhas de três espécies de eucalipto e 2) avaliar a atividade destes óleos sobre o mosquito Aedes aegypti. O projeto inclui a coleta e análise química dos óleos por cromatografia gasosa, bem como testes de atividade sobre ovos, larvas, pupas e adultos de A. aegypti.

1. Alda Ernestina dos Santos
23/10/2014
1
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Pesquisas de Produtos Naturais
Composição química e atividade inseticida
dos óleos voláteis das folhas de Eucalyptus
spp. utilizadas pela população de Luz-MG no
combate à dengue
Projeto de Pesquisa para Exame de Qualificação

2. 2
INTRODUÇÃO Óleos voláteis
Características
Plantas aromáticas (Asteraceae, Poaceae, Lamiaceae, Myrtaceae, Zingiberaceae,
Pinaceae, Apiaceae, Cupressaceae)
“Produto obtido a partir de matéria prima vegetal por hidrodestilação ou
destilação por arraste a vapor; ou partir do epicarpo de espécies de Citrus por
processo mecânico” (Norma ISO 9235.2)
Produzidos por estruturas secretoras especializadas
Geralmente líquidos voláteis, lipossolúveis, incolores e menos densos que a água
Funções diversas nos vegetais
Cerca de 20-60 componentes (majoritário(s) com 20-70% de abundância)
Predominância de terpenos principalmente monoterpenoides (90%) e
sesquiterpenoides
Bakalli et al. (2008); Schmidt (2010); Vitti & Brito (2003); Franz & Novak (2010)

3. 3
INTRODUÇÃO Óleos voláteis
Terpenos
Figura 1: Exemplos de terpenos componentes de óleos voláteis diversos
Monoterpenos
O
O
Citronelal
Cymbopogon winterianus
Neral
Citrus x limon
Pulegona
Mentha pulegium
Dewick (2002)
O
Thujona
Artemisia absinthium
α-felandreno
Zingiber officinale
OH
Mentol
Mentha x piperita
Sesquiterpenos
O
α-bisaboleno
Origanum vulgare
α-gurjuneno
Achyrocline satureoides
α-humuleno
Humulus lupulus
β-cariofileno
Cinnamomum zeylanicum

4. 4
INTRODUÇÃO Óleos voláteis
Atividade sobre insetos
Atividade inseticida e/ou repelente
Atividade sobre Aedes, Anopheles e Culex
Óleo de citronela – 1901 até 1940
Citronela, limão e eucalipto – repelentes de uso tópico recomendados pela US Environmental
Protection Agency
Menos tóxicos para os organismos não alvos
Geralmente não induzem à resistência
Menor ecotoxicidade
Mecanismos de ação não são bem estabelecidos
Curto período de ação devido à alta volatilidade
Toxicidade aguda em ratos
Oral: LC50 = 2170-3664 mg/Kg
Inalação: LC50 = 5.95 mg/L
Dérmica: LC50 = 4280 mg/Kg
Toxicidade aguda em ratos
Oral: LC50 = 4200 mg/Kg
Inalação: LC50 = 7.05 mg/L
Dérmica: LC50 = 5000 mg/Kg
Nerio et al. (2010); Katz et al. (2008);
George et al. (2014); Knaak & Fiuza (2010)
N
O
DEET
N,N- dietil-m-toluamida

5. 5
INTRODUÇÃO Eucalyptus
Características
Figura 2 : E. pilularis em área de cultivo
Myrtaceae; cerca de 700 espécies; origem Australiana
Eucalyptus = eu, “bem” + kalyptós, “coberto”
Fácil adaptação climática; cultivado em todo o mundo (madeira e óleos voláteis)
Árvores de grande porte e odor característico
Grande interesse comercial (indústrias farmacêutica e alimentícia e da perfumaria)
1855 - introdução de E. globulus no Brasil
http://biolinfo.org/cmkb/view.php?comname=cmkb_public&scid=545
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Starr_020203-0027_Eucalyptus_pilularis.jpg
Zrira et al. (2004); Cheng et al. (2009); Vitti & Brito (2003)
Figura 3 : Frutos secos de E. pilularis

6. 6
INTRODUÇÃO Eucalyptus
Óleos voláteis
Zrira et al. (2004); Doran (1991)
Brooker & Kleinig (2006)
Folhas, cascas, brotos e frutos
Apenas 200 espécies avaliadas quanto à composição química
Mistura de 50-100 componentes, principalmente monoterpenos
O
1,8-cineol
E. globulus
β-ocimeno
E. curtisii
β-pineno
E. tenuipes
α-pineno
E. rubiginosa
α-thujeno
E. alba
OH
globulol
E. camaldulensis
OH
espatulenol
E. alba
germacreno D
E. varia
OH
trans-nerolidol
E. deglupta
Figura 4: Exemplos de terpenos componentes dos óleos voláteis de Eucalyptus spp.

7. 7
INTRODUÇÃO Eucalyptus
Óleos voláteis
Tabela 1: Compostos majoritários observados em Eucalyptus spp. Coletadas em regiões diversas
Classificação quanto à composição
Medicinais – 1,8-cineol como majoritário (acima de 70%); produtos farmacêuticos
Industriais – felandreno ou piperitona; desinfetantes, obtenção do timol e mentol
Perfumaria – citral ou citronelal; essências
Tapondjou et al., (2005)Camarões39.5αααα-pinenoE. saligna
Medhi et al., (2010)Irã69.51,8-cineolE. camaldulensis
Vilela et al., (2009)Brasil89.91,8-cineolE. globulus
Elaissi et al., (2011)Tunísia54.01,8-cineolE. citriodora
Ribeiro et al., (2013)Brasil72.9(+) - limonenoE. staigeriana
Grbovic et al., (2010)Montenegro28.6p-cimenoE. camaldulensis
Oyedeji et al., (1999)Nigéria32.9αααα- thujenoE. alba
Zrira et al., (2004)Marrocos87.81,8-cineolE.cinerea
Brophy et al., (2009)Austrália31.0ββββ-pinenoE. tenuipes
Cheng et al., (2009)Taiwan22.52αααα-pinenoE. camaldulensis
ReferênciaPaís da coleta(%)CompostoEspécie
Bizzo et al. (2009)
7

8. 8
INTRODUÇÃO Eucalyptus
Atividade inseticida e repelente
Tabela 2: Atividade de Eucalyptus spp. sobre espécies diversas de insetos
Maciel et al. (2010) ; Batish et al. (2008)
Potencialidade como inseticida e/ou repelente
Baixa toxicidade para mamíferos
Facilidade de obtenção
A. aegypti
Larvicida
Adulticida
Repelente
Manimaran et al., (2013)Aedes aegyptiLarvicidaE. globulus
Alzogaray et al., (2011)Blattella germanicaNinficidaE. dunnii
Yang et al., (2004)Pediculus humanusOvicidaE. globulus
Lucia et al., (2009)Aedes aegyptiFumiganteE. grandis
Kumar et al., (2012)Musca domesticaPupicidaE. globulus
Medhi et al., (2010)Anopheles stephensiLarvicidaE. camaldulensis
Sritabutra & Soonwera (2013)Aedes aegyptiRepelenteE. citriodora
Roh et al., (2013)Tetranychus urticaeRepelenteE. elata
Jemâa et al., (2013)Ectomyelois ceratoniaeAdulticidaE. camaldulensis
ReferênciaEspécie alvoAtividade
avalidada
Espécie
9

9. 10
INTRODUÇÃO Dengue
Figura 5: Municípios brasileiros infestados com A. aegypti
OMS (2002) ; Barreto & Teixeira (2008)
Presente em mais de 100 países
50-100 milhões de casos anuais
2,5 bilhões de pessoas em áreas de risco
Aedes aegypti – DENV-1; DENV-2, DENV-3 e DENV-4
Controle – inseticidas sintéticos e campanhas de sensibilização
http://noticias.r7.com/saude/noticias/numero-de-mortes-por-dengue-20100711.html

10. 10
INTRODUÇÃO Luz-MG
Tabela 3: Casos de dengue notificados no Brasil, Minas Gerais e Luz entre 2009-2013
IBGE (2006) ; IBGE (2010)
17.486 habitantes
Agricultura e pecuária
Cultivo de Eucalyptus spp. (fonte de madeira)
693 hectares de área plantada
35.000 toneladas anuais
Espécies mais cultivadas: E. pellita, E. pilularis, E. paniculata e E. saligna
Uso popular das folhas (sub produto) no combate ao Aedes aegypti

11. 11
Geral
OBJETIVOS
Estudo da composição química dos óleos voláteis das folhas de E.
pilularis, E. pellita e E. saligna, bem como avaliação de sua
atividade sobre Aedes aegypti
Específicos
I) Obtenção dos óleos voláteis através da hidrodestilação
II) Análise da composição química por CGAR-EM
III) Determinação das propriedades físicas dos óleos obtidos
IV)Avaliação da atividade sobre ovos, larvas, pupas e insetos
adultos de A. aegypti

12. 12
JUSTIFICATIVA
I) Grande interesse científico e popular sobre Eucalyptus spp.
II) Potencial dos óleos voláteis como fonte de substâncias inseticidas e/ou
repelentes
III) Escassez de estudos químicos com E. pilularis, E. pellita e E. saligna
IV) Importância de agregar valor aos sub-produtos destas espécies
V) Necessidade da busca por alternativas no controle de Aedes aegypti
VI) Relevância de estudos que visem à confirmação científica das
propriedades relatadas pelo uso popular de espécies vegetais

13. 13
METODOLOGIA
Coleta das folhas
E. pilularis, E. pelitta, E. saligna
Secagem à sombra
5 dias
Óleos voláteis
Composição química e qualidade
Hidrodestilação
Identificação
Botânica
Prof. Cassia Sakuragui
Análise por CGAR-EM
Clevenger por 3 horas
Controle de qualidade
Óleo volátil
Coluna: DB-5 ms (25m x 0.25mm x 0.25µm)
Injetor: 260°C; Detector: 290°C; 1 mL/min.
60-290°C (3°C/min)
NIST 21 e NIST 107;
Índice de Kovats; Adams (2007)
Densidade relativa – picnômetro (20°C)
Rotação óptica – polarímetro Acatec PD-5000
Índice de refração – refratômetro de Abbe 2WAJ
Teor de 1,8-cineol – CGAR-EM
ISO 3044
Densidade relativa (20°C) = 0,858 – 0,877
Rotação óptica (20°C) = (-2) a (+4)
Índice de refração = 1,4500 – 1,4590
Teor de 1,8-cineol > 70%

14. 14
METODOLOGIA
Colônia de cultivo
10-12 dias
Óleos voláteis
Atividade sobre A. aegypti
Ovos
Larvas
Ovos A. aegypti
Instituto de Biologia
do Exército
Atividade ovicida (48 horas)
12.5 – 150 ppm
tiras com 100 ovos
(-) tween 80 (0,01%)
Atividade larvicida (24 horas)
25 – 200 ppm
25 larvas de 3° estádio
(+) temefós (6ppm); (-) tween 80 (0,01%)
Pupas
Atividade pupicida (24 e 48horas)
75 – 250 ppm
25 pupas recém emergidas
(+) temefós (6ppm); (-) tween 80 (0,01%)
Fêmeas adultas
Atividade adulticida (24 horas)
150 – 500 ppm
20 fêmeas (5-6 dias de idade)
60 min. exposição kit OMS
(+) dichlorvos (0,8 ppm)
Atividade repelente
0.5, 1 e 2 mg/cm2
50 fêmeas (4-8 dias de idade)
(+) OFF! (SC Johnson)
Análise estatística
média ± desvio padrão, % de mortalidade, % de proteção
LC50 e LC90 por análise de Probit
Anova – teste de Tukey 5% significância 14
Govindarajan et al. (2011)
OMS (2005)
Panneerselvam et al. (2011)
OMS (1981)OMS (2009)

15. Resultados Esperados
15
Conhecer a composição química dos óleos voláteis
Resultados experimentais X uso popular; agregar valor às folhas
Controle de qualidade. Interesse comercial?
Avaliação em diferentes estágios de desenvolvimento = resultados mais completos
Atividade larvicida – análise por MEV, possíveis modificações estruturais
Atividade adulticida – análise da composição química do vapor do óleos
empregando HS-SPME CG-EM
Atividade repelente – análise da atividade repelente das velas produzidas com o
sumo das folhas de Eucalyptus spp.
Perspectivas

16. 16
Equipe Envolvida
Identificação botânica das espécies
Profª. Cássia M. Sakuragui – IB/UFRJ
Química
Prof. Ricardo M. Kuster – IPPN/UFRJ
Msc Alda Ernestina dos Santos
Atividade Biológica
Profª. Naomi Kato Simas – FF/UFRJ
Celso Evangelista dos Santos – IPPN/UFRJ
Alunos
Mestrando – 1 aluno
Iniciação científica – 2 alunos

17. 17
Orçamento Material de consumo
Quadro 1: Gastos com material de consumo
R$ 671,50Gasto total com material de consumo
10,45500 g10,45Cultivo dos insetosSacarose
100,00-100,00DiversasMaterial de escritório
109,002 ml109,00CromatografiaPadrão de n-alcanos
33,70250 g33,70Tratamento dos óleosNa2SO4 anidro
12,606 Pcts. 100 unid.2,10Teste larvicidaCopos descartáveis
64,00Pct. 1000 unidades64,00Testes biológicosPonteiras micropipeta
24,80Pct. 100 unidades24,80Cultivo dos insetosPipetas descartáveis
7,95500 g7,95Cultivo dos insetosRação canina
48,003 unidades16,00Testes biológicosRack para tubos
53,00Pct. 500 unidades53,00Testes biológicosTubos eppendorf
90,002 x 50 mL45,00Testes biológicosTween 80
18,00200 mL18,00Teste de repelênciaOFF! spray
95,00250 mg95,00Teste larvicidaTemephos
50,00250 mg50,00Teste inseticidaDichlorvos
Valor totalQuantidadeValor
unitário
FinalidadeMaterial
Material de consumo (valores expressos em reais)

18. 18
Orçamento Material permanente
Quadro 2: Gastos com material permanente
R$ 5761,00Total solicitado para a realização do projeto
R$ 5044,50Gasto total com material permanente
204,002102,00HidrodestilaçãoSuporte universal
74,00174,00HidrodestilaçãoTermômetro
346,001346,00HidrodestilaçãoManta aquecedora
349,001349,00HidrodestilaçãoAparato tipo Clevenger
34,5056,90Cultivo dos insetosBandeja plástica
158,001158,00Det. da densidadePicnômetro
1940,0011940,00Det. índice de refraçãoRefratômetro de Abbe
369,001369,00Coleta do material vegetalPodão e cabo extensor
1200,003400,00Testes biológicosMicropipeta monocanal
370,001370,00Testes biológicosAgit. tubos tipo vórtex
Valor totalQuantidadeValor
unitário
FinalidadeMaterial
Material permanente (valores expressos em reais)

19. Cronograma de Execução
19
XXXXXElaboração de artigos e relatórios
científicos
XXXXApresentação em eventos científicos
XXXXXAnálise dos resultados obtidos
XXXAvaliação das atividades inseticida e
repelente
XXImplementação da colônia de A. aegypti
XXXAnálise da composição química dos
óleos
XXDeterminação das propriedades físico
químicas
XXObtenção dos óleos voláteis das folhas
XColeta e identificação de Eucalyptus
spp.
XPesquisa e levantamento bibliográfico
87654321
TRIMESTRESATIVIDADE
Quadro 3: Cronograma de execução

20. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
20
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review. Food and chemical toxicology, v. 46, n. 2, p. 446–475, 2008.
BARRETO, M.L.; TEIXEIRA, M.G. Dengue no Brasil: situação epidemiológica e contribuições para
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BATISH, D.R.; SINGH, H.P.; KOHLI, R.K.; KAUR, S. Eucalyptus essential oil as a natural pesticide.
Forest Ecology and Management, v. 256, n. 12, p. 2166–2174, 2008.
BIZZO, H. R. et al. Óleos essenciais no Brasil: aspectos gerais, desenvolvimento e perspectivas.
Química Nova, v. 32, n. 3, p. 588–594, 2009.
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CHENG, S.S.; HUANG, C.G.; CHEN, Y.J.; YU, J.J.; CHEN, W.J.; CHANG, S.T. Chemical
compositions and larvicidal activities of leaf essential oils from two eucalyptus species.
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KNAAK, N.; FIUZA, L. Potencial dos óleos essenciais de plantas no controle de insetos e
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MACIEL, M. V et al. Chemical composition of Eucalyptus spp . essential oils and their insecticidal
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http://whqlibdoc.who.int/hq/2009/WHO_HTM_NTD_WHOPES_2009.4_eng.pdf. Acesso em: 05 de
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SCHMIDT, E. Production of essential oils. In: CAN BASER, K.H.; BUCHBAUER, G. Handbook of
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VITTI, A.M.S.; BRITO, J.O. Óleo essencial de eucalipto. ESALQ, Documentos Florestais, n. 17,
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19, n. 2, p. 172–175, 2004.

24. UMA BREVE HISTÓRIA DA MEDICINA
Doutor eu tenho uma dor ...
2000 a.C. - Aqui, coma essas raízes.
1000 d.C. - Raízes são pagãs, reze.
1850 d.C. - Rezas são superstição, beba essa poção.
1940 d.C. - Essa poção é inútil, tome essa pílula.
1985 d.C. - Essa pílula é inócua, tome esse antibiótico.
2000 d.C. - Antibiótico é artificial, coma essa raiz.
24