O documento discute medicamentos recombinantes, especificamente no tratamento da doença de Fabry. Descreve como a enzima alfa-galactosidase A é produzida através da engenharia genética em leveduras para substituir a enzima deficiente nesses pacientes, permitindo a digestão do glicoesfingolípido GL-3 que de outra forma se acumularia. O processo de purificação da enzima recombinante é detalhado.

1. 1º SEMINÁRIO DE BMC MEDICAMENTOS RECOMBINANTES Prof. : Dr. Célia Carvalho TP: 2 Cátia Barão Carolina Correia Francisco Santos Vânia Caldeira

2. MEDICAMENTOS RECOMBINANTES - O QUE SÃO? – Produtos da biotecnologia e engenharia genética Recurso a microorganismos e culturas de células para produção de substâncias com finalidade terapêutica Utilização da técnica de DNA recombinante para introduzir o segmento de material genético capaz de codificar a substância pretendida (enzimas, proteínas, hormonas, etc.) “ Fábrica biológica”

3. Situações Clínicas Diabetes (a insulina foi um dos primeiros medicamentos recombinantes a ser comercializado) Nanismo e outros problemas de crescimento (produção de hormonas de crescimento recombinantes) Hepatite B (a vacina foi a primeira a ser produzida por técnicas recombinantes)

4. Situações Clínicas Doença de Gaucher (produção de glicocerebrosidase para substituição enzimática) Cancro (vários tratamentos administrados a doentes com cancro são proteínas recombinantes - Herceptin) Transplantes (medicamentos recombinantes que evitam a rejeição) Ainda em estudo: medicamentos recombinantes para doença de Pompe, esclerose múltipla, artrite reumatóide, etc…

5. Situação Clínica Abordada DOENÇA DE FABRY (angioqueratoma corpóreo difuso) O que é? Alteração ligada ao sexo, caracterizada pela deficiência da enzima alfa-galactosidase A. Acumulação celular intralisossómica e deposição generalizada do glicoesfingolípido, globotriasosilceramida ou GL-3, nos vasos de múltiplos sistemas .

6. Situação Clínica Abordada Porque acontece? Mutação de um gene presente no cromossoma sexual X, de carácter recessivo Homens maioritariamente afectados Mulheres heterozigóticas portadoras geralmente sem sintomas Indivíduos masculinos do grupo sanguíneo AB ou B – evolução clínica mais grave

7. Situação Clínica Abordada Sintomas Erupções cutâneas Dor Transpiração afectada Alterações oculares Prejuízo ou dano de órgãos e sistemas importantes (problemas renais, cardíacos e sistema nervoso central, factores emocionais)

8. Situação Clínica Abordada Medicamentos recombinantes aplicados à doença de Fabry Problemas desta técnica enquanto terapia eficaz: - Actualmente tem custos muito elevados o que a torna pouco acessível; - Taxa de absorção da enzima recombinante por parte dos lisossomas ainda é muito baixa; - Não “cura” a doença definitivamente, requer tratamentos periódicos através de injecções de enzimas recombinantes no organismo Incapacidade de produção da enzima lisossómica α -GalA Incapacidade de digerir GL-3 Tratamento por reposição da enzima α -GalA Produção de enzima recombinante α -GalA em sistemas biológicos

9. Situação Clínica Abordada Processo de produção da enzima recombinante Criação de estirpe de Saccharomyces cerevisiae (HPY21G) A partir de estirpe que não contém genes responsáveis pela produção de proteínas antigénicas para o nosso organismo e que tem capacidade de se manosilforilar (gene MNN4) – HPY21; Introdução do gene para α -GalA humana no locus TRP1 estirpe HPY21. Após processos de purificação, as enzimas resultantes do metabolismo da levedura apresentam cadeias fosforiladas mas com “cap” de resíduos de manose que deve ser removido para enzima ser reconhecida por receptores da membrana de manose-6-fosfato por isso recorre-se ao tratamento de sobrenadante contendo enzimas produzidas com α -manosidase (de bactérias).

10. Situação Clínica Abordada Após este tratamento, as enzimas obtidas devem passar por um novo processo de purificação final de forma a obtermos as enzimas com as características pretendidas. Em experiências verificou-se que as enzimas recombinantes resultantes deste processo digeriram, com uma eficiência semelhante à de enzimas naturais do organismo, partículas de glicolipidos derivados de GL-3. Verificou-se igualmente que a absorção lisossomal da enzima depende em muito da disponibilidade dos receptores de manose-6-fosfato. Ensaios clínicos recentes utilizaram 2 formas diferentes da enzima recombinante: agalsidase beta (produzida em células de ovário de hamsters chineses) e agalsidase alfa (produzida em células de fibroblasto humanas).

11. Situação Clínica Abordada PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA CENTRIFUGAÇÃO DAS CULTURAS DE BACTÉRIAS RECOLHA DAS BACTÉRIAS LISE DAS BACTÉRIAS Preparação de um extracto que contenha todas as proteínas no seu interior, incluindo aquela que as bactérias foram induzidas a expressar em maior quantidade Ressuspendem-se as bactérias numa solução que contenha uma enzima capaz de enfraquecer a parede das mesmas Cromatografia, em que a proteína pretendida, e que supostamente existe em maior quantidade, é separada das proteínas da bactéria, aproveitando as diferentes propriedades químicas e físicas em comparação com as restantes proteínas da bactéria. Para verificar que a proteína atingiu um estado de purificação adequado procede-se à Electroforese em gel de acrilamida, uma técnica que permite observar através das propriedades de ligação da proteína a corantes específicos, a pureza da proteína obtida. Isto é possível utilizando um gel que vai ajudar a avaliar o peso molecular da proteína.

13. Terapêuticas tradicionais Vs. Tecnologia Recombinante Terapêuticas tradicionais: Insulina: Durante muito tempo foi purificada a partir do pâncreas de suínos e bovinos (pouco eficiente e dispendioso que, devido às diferenças entre a insulina animal e humana, provocou alergias graves e risco de vida para os doentes. Hormonas de crescimento: Como apenas a proteína produzida por seres humanos resulta como tratamento esta era obtida a partir do cérebro de cadáveres humanos (encarecimento da produção e risco de transmissão de agentes infecciosos). Hormonas para a fertilidade: Eram extraídas e purificadas a partir da urina de mulheres na menopausa.

14. Terapêuticas tradicionais Vs. Tecnologia Recombinante Benefícios da Tecnologia Recombinante: Maior pureza e tolerabilidade: menos probabilidade de causar reacções alérgicas Maior disponibilidade (não há necessidade de esperar por doadores ou cadáveres) Maior eficácia e segurança (menos infecções) Maior conforto para o paciente (possibilidade de injecções subcutâneas e não intramusculares) Maior controlo do processo.

15. Bibliografia Livros: - COOPER, Geoffrey M.; HAUSMAN, Robert E., “The Cell – A Molecular Approach”, ASM Press e Sinauer Associates, 4ª edição, 2007 - BENUMOF, Jonason L. , “Anesthesia and uncommon diseases”, W. D. Saunders, 4ª edição, 1998 - HARRISON’S, “Principles of Internal Medicine”, Volume 2, McGraw-Hill, 12ª edição, 1991 Artigos: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed- YASUNORI Chiba, HITOSHI Sakuraba, MASAHARU Kotani, RYOICHI Kase, KAZUO Kobayashi, MAKOTO Takeuchi, SATOSHI Ogasawara, YUTAKA Maruyama, TASUKU Nakajima, YUKI Takaoka and YOSHIFUMI Jigami , “ Production in yeast of α-galactosidase A, a lysosomal enzyme applicable to enzyme replacement therapy for Fabry disease”, Maio 2002 Internet: http://www.google.com http://www.wikipedia.org http://www.genzyme.com.br http://www.fabrycommunity.com http://www.espacorealmedico.com.br http://www.fabry.org http://www.apagina.pt/arquivo/ImprimirArtigo.asp?ID=3689 http://usinfo.state.gov/journals/ites/1005/ijep/snyder.htm http://www.fertilidadeonline.com.br/latam_brazil/treatment/Personalised_Treatment/What_is_Recombinant.jsp