Citometria de fluxo

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Citometria de fluxo

  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045 Trabalho realizado pela Doutoranda de Imunologia da UFBA Danielle Dantas Lima sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Cláudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
  2. 2. o DEFINIÇÃO: • É uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo conhecida também por citometria de fluxo multiparamétrica. Através de um aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de características físicas e/ou químicas de uma simples célula. O citômetro de fluxo é um aparelho utilizado para avaliação da emissão de fluorescência das células (FACS – Fluorescence Activated Cell Sorter).
  3. 3. • Os anticorpos monoclonais são os reagentes de escolha devido à sua especificidade, reação cruzada mínima e reprodutibilidade. O citômetro de fluxo mede as propriedades de dispersão de luz pelas as células e a emissão de luz de anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula.
  4. 4. • VANTAGENS • Mede múltiplos parâmetros em células individuais; • Grande número de células analisadas com rapidez; • Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos; • Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares;
  5. 5. o APLICAÇÕES • Fenotipagem dos leucócitos • Fenotipagem de células tumorais - Diagnóstico e classificação das leucemias e dos linfomas • Análise de DNA • Análise da função dos neutrófilos • Contagem de reticulócitos
  6. 6. o APLICAÇÕES EM MEDICINA VETERINÁRIA • Quantificação de subpopulações linfocitárias • Quantificação das células CD34+ como indicação da capacidade de reconstituição hematopoiética após o transplante de células-tronco • Avaliação de eritrócitos • Avaliação de plaquetas
  7. 7. • As células, uma vez em suspensão, são orientadas em um fluxo laminar e interceptadas uma a uma por um feixe de luz (LASER). • Um número de detectores são apontados ao local onde o fluxo passa através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) além de um ou mais detectores fluorescentes. Cada partícula suspensa passando através do feixe dispersa a luz de uma forma, e os fluorocromos fluorescentes encontrados na partícula podem ser excitados emitindo luz de menor frequência do que o da fonte de luz. Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é melhorada pelos dectetores, e analisando as flutuações de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente) é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e química de cada partícula.
  8. 8. Detector de dispersão de luz em ângulo de 90º Complexidade celular SSC (Side Scatter) Detector de dispersão de luz frontal Tamanho celular FSC (Forward Scatter) Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm
  9. 9. ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC) ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC) LASER CÉLULA
  10. 10. 3)Dispersão lateral de luz 1)Suspensão de células Laser 3)Dispersão de luz para a frente 4)Filtro 6) Análise de dados 5)A luz refletida passa através de filtros e é detectada por tubos fotomultiplicadores que convertem o sinal luminoso em sinal eletrônico 2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula
  11. 11. Linfócito TCD4 Anticorpos monoclonais marcados Linfócito TCD8 Citometria de fluxo Luz fluorescente Laser Contagem das células
  12. 12. Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal) Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro. Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmente Os círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos
  13. 13. Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência) Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3- Neste quadrante estão as células CD4- e CD3- (células que não linfócitos) Neste quadrante estão as células CD4- e CD3+ (outros linfócitos que não Th) Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3+ (linfócitos Th)

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