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Esta técnica é realizada pôr etapas:• 1o etapa: faz-se a imersão do corte histológico em solução com anticorpo  não marcad...
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Microscopia

  1. 1. Técnicas Especiais:1- Radioautografia: A radioautografia é uma técnica em que é possível a localização desubstâncias radioativas nos tecidos, esta baseia-se no efeito das radiaçõessobre as emulsões fotográficas. Nesta técnica cristais microscópicos debrometo de prata, contidos na emulsão fotográfica, agem comomicrodetectores da radioatividade; esses cristais atingidos pela radiação edepois de revelados transformam-se em grãos de prata metálica (aparecendonegros ao microscópio), caracterizando a presença de radioatividade nasestruturas que com este estão em contato. Uma radioautografia é obtida da seguinte maneira: um corte de órgão, como isótopo radioativo previamente injetado no animal, é posto em contato comuma película de emulsão fotográfica. Logo após, um certo tempo, a película érevelada e os pontos negros que nesta aparecerem vão corresponder aos locaisdo órgão que contêm o isótopo. Como a quantidade de grãos de prata érelativa à radioatividade presente, a radioautografia, permite que essaradioatividade também possa ser medida. Essa técnica também foi adaptada para o uso em microscópios eletrônicos,onde a emulsão é colocada sobre os cortes finos de material embebido emresinas sintéticas; mas devido ao seu grande poder de aumento os grãos deprata em sua maioria não aparecem globosos, mas como filamentosenovelados. Esse método tem sido largamente utilizado para o estudo de importantesfenômenos biológicos como pôr exemplos a síntese de proteínas e ometabolismo de D.N.A . Então pôr definição de radioautografia obtemos que: “o uso combinado demoléculas radioativas e suspensões de brometo de prata em gelatina é abase de sua técnica”. 1
  2. 2. ILUSRAÇÕES:2- Centrifugação fracionada: Denomina-se centrifugação fracionada o processo físico que aplica a 2
  3. 3. força centrífuga para separar organelas celulares, de acordo com o coeficientede sedimentação de cada uma. Este depende do tamanho, forma e densidadeda partícula e também da viscosidade e densidade do meio. Fases da técnica:• De início remove-se o órgão em estudo de um animal recém- sacrificado, esse órgão deve ser picados em pedaços muito pequenos e colocados em solução apropriada, como pôr exemplo sacarose e resinas plásticas solúveis e inertes de diferentes composições podem ser utilizadas para constituírem uns meios de viscosidades e densidades diversas.• Logo em seguida, os fragmentos de órgão em suspensão são colocados em um cilindro de vidro onde dento gira em grande velocidade um êmbolo ligado a um motor elétrico, esse equipamento é denominado homogeneizador. Os fragmentos dos tecidos são atritados acabam liberando as organelas.• Encerrado este processo deixa-se a suspensão em repouso pôr alguns minutos para que as células que ficaram intactas e as fibras do tecido conjuntivo possam se sedimentarem. Então inicia-se a centrifugação do sobrenadante com rotações cada vez maiores, sendo assim as organelas mais densas se sedimentam primeiro, e cada vez que o sobrenadante é submetido a forças centrífugas cada vez maiores obtem-se a separação dos diversos componentes celulares. Um aperfeiçoamento deste tipo de centrifugação é a centrifugação contragradiente. O gradiente consiste em uma solução cuja concentração é máxima no fundo do tubo e mínima na superfície, apresentando um aumento gradual da concentração de cima para baixo. Sobre o gradiente homogeneizado celular e se faz a centrifugação. As partículas migram em direção centrífuga e param onde ocorre um equilíbrio entre a ação da força centrífuga e a tendência de flutuação da partícula. Essa técnica permite a obtenção de frações mais puras. OBS.: todas as etapas de ambas as técnicas são realizadas em baixas temperaturas, para impedir que os sistemas enzimáticos funcionem o que lesaria as organelas durante sua separação.Ilustrações: 3
  4. 4. 3- Imunocitoquímica: 4
  5. 5. Essa técnica tem como base o seguinte fato: quando uma macromoléculaestranha (antígeno), é introduzida em um organismo, este reage produzindouma proteína denominada anticorpo; que pôr sua vez combinaespecificamente com o antígeno. Nesta técnica podem ser utilizadosmarcadores acoplados a anticorpos, sem que este perca a capacidade de secombinar com o antígeno, para isso a técnica imunocitoquímica se divide emdois tipos: direta e indireta. São 3 os métodos mais usados para marcar os anticorpos:• Conjunção com composto fluorescente: esta técnica é possível devido a identificação do anticorpo e do antígeno a que ele se liga, pelo emprego microscópio de fluorescência.• Conjunção com uma enzima: neste caso o anticorpo é localizado pôr meio de técnicas histoquímicas usualmente empregadas para enzimas. A mais utilizada é a peroxidase que pode ser visualizada tanto no microscópio óptico como o eletrônico.• Conjunção com uma substância que não se deixa atravessar pela luz e que dispersa elétrons: o mais utilizado é o ouro pois suas partículas podem ser vistas tanto no microscópio óptico como no eletrônico.Técnica direta: Supondo-se de um determinado órgão de um certo animal possa se extraire purificar quimicamente uma proteína, que será chamada de X (antígeno),deseja-se então saber em que célula ou estrutura do órgão que ela estalocalizada, pois esta foi retirada de um órgão inteiro. Injetando-se a proteína Xnum coelho, este formara um anticorpo com propriedade de se combinarsomente com ela. logo após um determinado tempo, do sangue do coelho,pode se extrair e purificar o anticorpo contra a proteína X. Este anticorpo podeser ligado a um composto fluorescente podendo assim ser identificado aomicroscópio. Então mergulhando-se um corte do mesmo órgão do qual se obteve aproteína X numa solução que contenha o anticorpo marcado, haverá umacombinação dos dois e os componentes teciduais que contem a proteína Xserão visíveis.Técnica indireta: 5
  6. 6. Esta técnica é realizada pôr etapas:• 1o etapa: faz-se a imersão do corte histológico em solução com anticorpo não marcado, obtido do sangue de um animal no qual foi injetado um antígeno que deseja-se determinar a localização, o anticorpo fixa-se ao antígeno que não pode ser observado ao microscópio pois o anticorpo não esta marcado.• 2o etapa: emerge-se o preparado em uma solução com antianticorpo (antigamaglobulina), este antianticorpo marcado fixa-se ao anticorpo que já esta ligado ao antígeno revelando sua localização.Os métodos de imunocitoquímica tem sido aperfeiçoados para que se obtenhauma localização cada vez mais precisa das macromoléculas pesquisadas, umdesses métodos aperfeiçoados é o do ouro-proteína A que tem contribuídomuito para as pesquisas em biologia celular. 6
  7. 7. Microscópio de Fase: O estudo microscópio de tecidos vivos é muito difícil, sendo que seuscomponentes na maioria são incolores e transparentes. Pôr isso que é utilizadoo microscópio de contraste de fase, pois este permite o estudo de muitosdetalhes celulares in vivo . a velocidade com que a luz atravessa um corpo e oíndice de refração deste dependem da quantidade de matéria presente(densidade), então quanto maior a densidade menor será a velocidade da luzno interior desse corpo e menor também o índice de refração. Como as diversas estruturas celulares tem índices de refração diferente,causam atrasos diferentes nas ondas luminosas que as atravessam, dandoorigem a diferenças de fase entre as ondas luminosas emergentes que nãopodem ser visíveis. No microscópio de fase existem dispositivos especiais quetransformam essas diferenças de fase em diferenças de amplitude pôrconseqüência diferença na intensidade luminosa, a qual a retina é sensível.Microscópio de Polarização: A luz, ao atravessar um filtro polaróide, torna-se polarizada, ou seja, passaa vibrar em uma única direção. Com o segundo filtro colocado nomicroscópio, acima do primeiro e com seu eixo perpendicular, a luz nãoatravessa o conjunto. O primeiro filtro é chamado de polarizador e é colocadono condensador, já o segundo filtro é colocado entre a objetiva e a ocular e édenominado analisador. Quando entre os dois filtros existem estruturas contendo moléculasorientadas (Ex.: celulose, colágeno ...), essas estruturas apareceram brilhantescontra um fundo escuro, isto ocorre porque as moléculas orientadas sãoanisotrópicas e modificam o eixo de luz recebida do polarizador.Microscópio de Fluorescência: Diz-se substâncias fluorescentes, quando algumas substâncias sãoexcitadas pôr determinados comprimentos de onda, onde estas absorvemenergia e emitem luz de maior comprimento de onda. Nos microscópiosutilizam luz com fonte ultravioleta, onde as substâncias fluorescente aparecemcomo estruturas brilhantes contra um fundo escuro, após a lente objetiva sãocolocados filtros que permitem a passagem da luz ultravioleta, mas eliminam apassagem da radiação para proteger os olhos do observador. Vários corantes que são fluorescente, e que tenham afinidade pôr certoscomponentes celulares, são utilizados para sua identificação; como exemplo oalaranjado-de-acridina, que se liga ao D.N.A e ao R.N.A . Atualmente este tipo de microscopia tem sido muito utilizado para 7
  8. 8. localizar sondas fluorescentes, que são substancias diversas capazes de reagircom quantidades mínimas de determinadas moléculas intracelulares. Alocalização da sonda, pôr sua fluorescência, indica a presença da moléculacelular procurada.Microscópio Eletrônico: Também chamado de transmissão, possui uma alta resolução eapresentação de imagens com grande riqueza em detalhes. Os elétrons sãoproduzidos graças ao aquecimento no vácuo de um filamento, o catódio, quenão emite elétrons. Essas partículas são aceleradas devido a diferença depotencial de 60 a 100 KV que existe entre o filamento e o anódio (placaperfurada que forma um feixe de elétrons). Esse feixe é transmitido pôr lentes eletromagnéticas, parecida com a luzdo microscópio óptico. O condensador focaliza o feixe de elétrons no plano doobjeto, e a objetiva forma uma imagem desse objeto, essa imagem ainda éampliada pôr lentes projetoras e a imagem final dás-se sobre uma telafluorescente ou um filme fotográfico. Devido os elétrons serem facilmente desviados pelo objeto, são realizadoscortes muito finos de tecidos que são realizados em ultramicrótomos comnavalhas de vidro ou diamante.Microscópio Eletrônico de varredura: Também denominado de scanning electron microscope, nesse tipo demicroscópio é colocado entre a lente eletromagnética e o objeto uma bobinade varredura que provoca um desvio do feixe de elétrons, de tal modo que omesmo vai incidir ponto pôr ponto sobre o objeto em uma seqüênciadeterminada. O objeto pôr sua vez não se deixa atravessar pelo feixeeletrônico, devido a sua espessura e a evaporação de metal pesado sobre a suasuperfície. De tal modo que o feixe de elétrons que incide sobre o objeto (feixeprimário) sofre reflexões originando elétrons secundários que são capturadospôr detectores especiais que geram um sinal elétrico, transferindo para ummonitor de vídeo. 8
  9. 9. Comparação Entre o Microscópio Óptico Com o Microscópio EletrônicoAs principais diferenças entre o microscópio eletrônico com óptico é o poderde resolução, o limite de resolução dos melhores microscópios ópticos é de0,2µm, então o que determina a riqueza de detalhes fornecido pôr um sistemaóptico é o seu limite de resolução e não o seu poder de aumento. Já omicroscópio eletrônico possui um sistema de resolução muito maior que é de0,0001µm mostrando uma riqueza de detalhes surpreendentemente maior quea do microscópio óptico.Bibliografias consultadas:• Junqueira e Carneiro, Histologia Básica, 9o edição, editora Guanabara Koogan.• Junqueira e Carneiro, biologia molecular e celular. Texto gentilmente cedido pelo próprio autor (maloureiro@sti.com.br) www.sti.com.br 9

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