"Metodologias inovadoras para
ensaios diagnósticos"
Alexandre Dias T. Costa
Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBM...
O que são testes de diagnóstico?
• ferramentas auxiliares no diagnóstico
• acompanhamento de uma determinada condição ou
tratamento
• podem ser físicos, ps...
Objeto da palestra:
Mostrar a evolução das técnicas de diagnóstico, desde
os primeiros testes de detecção imunológica até ...
O passado
(mas nem tanto...)
Testes tipo ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay)
criados na década de 60 como alternativa aos métodos então
existente...
ELISA “indireto”
ELISA sanduíche
ELISA competitivo
Usos atuais
diversas doenças
gravidez (HCG)
contaminantes em alimentos
contaminantes ambientais
O presente
Novas plataformas e melhoria das plataformas existentes
Demanda x Tecnologia
Testes de Fluxo Lateral
Teste rápido para Dengue
Detecção do vírus (proteína NS1):
Glicoproteína viral presente nos pacientes infectados do primei...
Mas…
(Sempre tem um “mas”)
Testes tipo ELISA detectam antígenos
ou anticorpos
Problemas com a janela imunológica…
Problemas com a janela imunológica…
Qual a
opção????
Detectar o patógeno!
Como fazer para detectar o ácido nucleico do agente
infeccioso?
DICA: a metodologia tem que ser sensível, reprodutível,
es...
A solução é detectar o ácido nucléico
do agente infeccioso
PCR: Reação em cadeia da polimerase
Ao final de 35 ciclos, teremos mais de
1,5 bilhão de cópias do DNA alvo original
PCR convencional x PCR em tempo real
• Convencional
• Um par de iniciadores
• Análise por eletroforese em
gel
• Possibilid...
Projeto NAT HIV/HCV brasileiro
CNPSH/MS
Pooling +
PCR Setup
cDNA + PCR DetecçãoExtração RNA
One Source
Influenza A(H1N1)
• 2009: Teste fornecido pelo CDC (Center for Disease Control and
Prevention);
• Disponibilidade limitada...
• 2010: Produção completa do kit Influenza A(H1N1) pelo IBMP;
• Melhoria do produto: reação duplex
Demanda x Tecnologia
O futuro
Multitestes
Alta processividade
Point-of-care
Microarranjo (Biochips)
• Arranjo pré-definido de moléculas de DNA;
• Moléculas ligadas a uma superfície;
• Detecção e qua...
Microarranjo Líquido - Luminex
Multiteste para Hemorrede
Internal…
Chagas…
HBVAg1
HCVAg1
HCVAg2
HIVAg1
HIVAg2
HTLV…
HTLV…
HTLV…
HTLV2…
Syphilis…
Syphilis…
0
2000
4000
6000
8000
10...
Multiteste prénatal
Alvos: AIDS, Hepatite B e C, Rubéola, Sífilis, Doença de Chagas e Toxoplasmose
Amostra
Bead ativada com antígeno Bead ativada com controle
Pad absorvente
Buffer
UV
Câmera
Buffer
PCR Lab-on-a-chip (LOC)
Projeto PODITRODI - visa o desenvolvimento de uma plataforma tecnológica
para diagnóstico no ponto de atendimento (point o...
A inovação do PodiTrodi
Atualmente
• Três processos independentes:
• ELISA
• Extração do ácido nucléico
• qPCR
• Equipamen...
Cartucho para extração de ácidos nucléicos
(ENAS/Frauhnhofer)
Chagas
• duplex reaction
(target and internal
control)
• regular mastermix
• 1/3 of regular run
time (ABI7500)
• gelified ...
Gelification
Gelification consists in a process in which the PCR reagents are stabilized
by the addition of gelifying and ...
Chagas
• duplex reaction
(target and internal
control)
• regular mastermix
• 1/3 of regular run
time (ABI7500)
• gelified ...
Sequenciamento de Terceira Geração
Pirossequenciamento
SOLiD (oligonucleotídeos)
Illumina (corantes reversíveis)
Ion Torre...
Aplicações
tipagem HLA: redução do tempo de análise e maior acurácia
identificação de patógenos e resistência a drogas: UT...
Diagnóstico através de NGS
Diagnóstico de doenças com NGS
Diagnóstico de doenças com NGS
Proteômica na busca por biomarcadores
Diagnóstico mais precoce e acompanhamento mais refinado do tratamento, portanto
melh...
BioMEMS
(Biological MicroElectroMechanical Sensors)
BioMEMS refers to the science and technology of operating at the micro...
BioMEMS History
• 60s/70s – initial studies on functionalization of micro scale structures to manipulate their
biological ...
Materials approaches
• (glass)
• silicon
• plastics and polymers
• paper
Microfluidics
Lab on a Chip, 2011, 11: 1902
Current Opinion in Chemical Biology, 2012, 16: 243
DOI: 10.1515/bmt-2012-4425
Biosensors
• Micromechanical
• Electrical and electrochemical
• Optical
Biosens. Bioelectron. 2010, 26:1460
Sens. Actuator...
Biological chips
• Oligonucleotide chips
• Microarrays
• PCR chips
Projeto Sepsis - desenvolver um método para captura dos
agentes infecciosos diretamente de amostras de sangue total
acopla...
Silva et al., 2004
Sepse: síndrome de resposta inflamatória sistêmica desencadeada por um processo
de infecção generalizad...
Chancede
Sobrevivência(%)
Início do tratamento
adequado
Adaptado de Kumar et al., 2006
Tubo para
hemocultura,
1915
Tubo pa...
OBJETIVO GERAL
ENRIQUECIMENTO DETECÇÃO e
IDENTIFICAÇÃO
Captura Seletiva PCR-Array
Multiteste molecular
- Especificidade
- ...
Captura Seletiva
105 102 100M +
Sangue contaminado
artificialmente: P. aeruginosa
In-Check: Plataforma Lab-On-Chip (LOC)
Tecnologia: PCR-Array
PCR chips
Tempo do teste a partir de
amostras de DNA extraído
Nossa Proposta
Tempo total do teste: 2h
Coleta de
sangue
Captura
Detec...
Point of care
• Diagnostics
• Home care
• Insulin pumps
Eyenetra
(oftalmologista portátil)
Point of Care
• Glaucoma
Colaboradores
IBMP/ICC
Marco A. Krieger
Rita Rampazzo
Tahiana Brandalize
Camila B. Suarez
Cheysa A. Biondo
Leonardo Foti
I...
Obrigado pela atenção!
Alexandre Dias T. Costa
Instituto Carlos Chagas (ICC)
Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IB...
Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"
Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"
Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"
Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"
Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"
Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"
Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"
Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"
Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"
Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"
Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"
Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"
Próximos SlideShares
Carregando em…5
×

Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"

1.898 visualizações

Publicada em

0 comentários
4 gostaram
Estatísticas
Notas
  • Seja o primeiro a comentar

Sem downloads
Visualizações
Visualizações totais
1.898
No SlideShare
0
A partir de incorporações
0
Número de incorporações
98
Ações
Compartilhamentos
0
Downloads
48
Comentários
0
Gostaram
4
Incorporações 0
Nenhuma incorporação

Nenhuma nota no slide

Minicurso 2 - "Metodologias Inovadoras para ensaios diagnósticos"

  1. 1. "Metodologias inovadoras para ensaios diagnósticos" Alexandre Dias T. Costa Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP/FIOCRUZ-PR) Instituto Carlos Chagas (ICC/FIOCRUZ-PR)
  2. 2. O que são testes de diagnóstico?
  3. 3. • ferramentas auxiliares no diagnóstico • acompanhamento de uma determinada condição ou tratamento • podem ser físicos, psicológicos ou (bio)químicos O que são testes de diagnóstico?
  4. 4. Objeto da palestra: Mostrar a evolução das técnicas de diagnóstico, desde os primeiros testes de detecção imunológica até as mais novas ferramentas de biologia molecular. Serão também abordadas as diferentes capacidades de paralelização e de processividade de amostras, tanto dos diferentes testes existentes no mercado como dos testes atualmente em desenvolvimento no Brasil e no mundo.
  5. 5. O passado (mas nem tanto...)
  6. 6. Testes tipo ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) criados na década de 60 como alternativa aos métodos então existentes (radioativos) tipos: “indireto”, sanduíche, competitivo extremamente versáteis com relação ao tipo de amostra (sangue/soro, urina, saliva, ou outros fluidos)
  7. 7. ELISA “indireto”
  8. 8. ELISA sanduíche
  9. 9. ELISA competitivo
  10. 10. Usos atuais diversas doenças gravidez (HCG) contaminantes em alimentos contaminantes ambientais
  11. 11. O presente Novas plataformas e melhoria das plataformas existentes
  12. 12. Demanda x Tecnologia
  13. 13. Testes de Fluxo Lateral
  14. 14. Teste rápido para Dengue Detecção do vírus (proteína NS1): Glicoproteína viral presente nos pacientes infectados do primeiro ao nono dia após a infecção; Detecção de anticorpos específicos contra o vírus: IgM: 5 a 10 dias após o aparecimento dos sintomas em infecções primárias (4 a 5 dias em infecções secundárias); IgG: após 14 dia do aparecimento dos sintomas;
  15. 15. Mas… (Sempre tem um “mas”) Testes tipo ELISA detectam antígenos ou anticorpos
  16. 16. Problemas com a janela imunológica…
  17. 17. Problemas com a janela imunológica… Qual a opção????
  18. 18. Detectar o patógeno!
  19. 19. Como fazer para detectar o ácido nucleico do agente infeccioso? DICA: a metodologia tem que ser sensível, reprodutível, específica, precisa, simples, rápida, com grande capacidade de processamento e possibilidade de automação.
  20. 20. A solução é detectar o ácido nucléico do agente infeccioso
  21. 21. PCR: Reação em cadeia da polimerase Ao final de 35 ciclos, teremos mais de 1,5 bilhão de cópias do DNA alvo original
  22. 22. PCR convencional x PCR em tempo real • Convencional • Um par de iniciadores • Análise por eletroforese em gel • Possibilidade de contaminação • Tempo real • Um par de iniciadores • Presença de uma sonda • Detecção simultânea à amplificação • Não existe a necessidade de se abrir o tubo para análise • Análise quantitativa
  23. 23. Projeto NAT HIV/HCV brasileiro CNPSH/MS
  24. 24. Pooling + PCR Setup cDNA + PCR DetecçãoExtração RNA One Source
  25. 25. Influenza A(H1N1) • 2009: Teste fornecido pelo CDC (Center for Disease Control and Prevention); • Disponibilidade limitada; • Problemas de importação; • Problemas de especificidade; • Problemas de processividade;
  26. 26. • 2010: Produção completa do kit Influenza A(H1N1) pelo IBMP; • Melhoria do produto: reação duplex
  27. 27. Demanda x Tecnologia
  28. 28. O futuro Multitestes Alta processividade Point-of-care
  29. 29. Microarranjo (Biochips) • Arranjo pré-definido de moléculas de DNA; • Moléculas ligadas a uma superfície; • Detecção e quantificação de ácidos nucleicos (RNAm na forma de cDNA ou DNA genômico); • Amostras são "marcadas" com fluorocromos; • Leitores a laser;
  30. 30. Microarranjo Líquido - Luminex
  31. 31. Multiteste para Hemorrede
  32. 32. Internal… Chagas… HBVAg1 HCVAg1 HCVAg2 HIVAg1 HIVAg2 HTLV… HTLV… HTLV… HTLV2… Syphilis… Syphilis… 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 4b1 5b1 6b6 8b6 10b3 14b5 15b4 Pool 2 HCV Multitest – multitest typical result Internal Control Chagas Ag 1 HBV Ag1 HCV Ag1 HCV Ag2 HIV Ag1 HIV Ag2 HTLV Ag1 HTLV Ag2 HTLV Ag3 HTLV2 Ag1 Syphilis Ag1 Syphilis Ag2
  33. 33. Multiteste prénatal Alvos: AIDS, Hepatite B e C, Rubéola, Sífilis, Doença de Chagas e Toxoplasmose
  34. 34. Amostra Bead ativada com antígeno Bead ativada com controle Pad absorvente Buffer UV Câmera Buffer
  35. 35. PCR Lab-on-a-chip (LOC)
  36. 36. Projeto PODITRODI - visa o desenvolvimento de uma plataforma tecnológica para diagnóstico no ponto de atendimento (point of care) para doenças tropicais, integrando teste sorológico e molecular num único dispositivo. DNA antibody From Coura and Borges-Pereira, Acta Tropica, 2010 A inovação do PodiTrodi
  37. 37. A inovação do PodiTrodi Atualmente • Três processos independentes: • ELISA • Extração do ácido nucléico • qPCR • Equipamentos diferentes • Semi automatizado A Proposta • Três processos sequenciais automatizados, num único equipamento portátil Pooling + PCR Setup Detecção por qPCR Extração RNA
  38. 38. Cartucho para extração de ácidos nucléicos (ENAS/Frauhnhofer)
  39. 39. Chagas • duplex reaction (target and internal control) • regular mastermix • 1/3 of regular run time (ABI7500) • gelified mix • template: DNA • status: in final stages of development
  40. 40. Gelification Gelification consists in a process in which the PCR reagents are stabilized by the addition of gelifying and stabilizing agents Good alternative to reduce the cost of cold chain transport Turns the PCR procedure extremely simple and fast to execute
  41. 41. Chagas • duplex reaction (target and internal control) • regular mastermix • 1/3 of regular run time (ABI7500) • gelified mix • template: DNA • status: in final stages of development
  42. 42. Sequenciamento de Terceira Geração Pirossequenciamento SOLiD (oligonucleotídeos) Illumina (corantes reversíveis) Ion Torrent (condutividade) Single molecule Vários outros... - Alta processividade - Baixo custo por sequência - Rapidez na obtenção de grande quantidade de informações
  43. 43. Aplicações tipagem HLA: redução do tempo de análise e maior acurácia identificação de patógenos e resistência a drogas: UTI Farmacogenética: biomarcadores Padrões de metilação, epigenética, polimorfismos...
  44. 44. Diagnóstico através de NGS
  45. 45. Diagnóstico de doenças com NGS
  46. 46. Diagnóstico de doenças com NGS
  47. 47. Proteômica na busca por biomarcadores Diagnóstico mais precoce e acompanhamento mais refinado do tratamento, portanto melhor prognóstico.
  48. 48. BioMEMS (Biological MicroElectroMechanical Sensors) BioMEMS refers to the science and technology of operating at the microscale for biological and biomedical applications, which may or may not include any electronic or mechanical functions. [Steven S. Saliterman (2006) Fundamentals of bio-MEMS and medical microdevices]
  49. 49. BioMEMS History • 60s/70s – initial studies on functionalization of micro scale structures to manipulate their biological properties • 60s/70s – Glucose monitors & home pregnancy tests • 1990 – Manz and Widmer: µTAS (micro total analysis system) • 1991 – first oligonucleotide chip • 1998 – first solid microneedles for drug delivery; first continous-flow PCR chip • 1999 – laminar flows in microchannels
  50. 50. Materials approaches • (glass) • silicon • plastics and polymers • paper
  51. 51. Microfluidics Lab on a Chip, 2011, 11: 1902 Current Opinion in Chemical Biology, 2012, 16: 243 DOI: 10.1515/bmt-2012-4425
  52. 52. Biosensors • Micromechanical • Electrical and electrochemical • Optical Biosens. Bioelectron. 2010, 26:1460 Sens. Actuators A Phys. 2006, 125, 273 Sens. Actuators A Phys. 2007, 135, 315 Appl. Phys. Lett. 2013, 102: 143702
  53. 53. Biological chips • Oligonucleotide chips • Microarrays
  54. 54. • PCR chips
  55. 55. Projeto Sepsis - desenvolver um método para captura dos agentes infecciosos diretamente de amostras de sangue total acoplado a um multiteste diagnóstico molecular rápido, fundamentado no conceito Lab-On-Chip (LOC), para a detecção e identificação desses patógenos e seus principais mecanismos de resistência a antimicrobianos.
  56. 56. Silva et al., 2004 Sepse: síndrome de resposta inflamatória sistêmica desencadeada por um processo de infecção generalizada, decorrente da invasão da corrente sanguínea por agentes infecciosos. BACTÉRIAS e FUNGOS PRINCIPAL CAUSA DE MORTE EM UTI Mortalidade(%) Adaptado de Siqueira-Batista et al., 2011
  57. 57. Chancede Sobrevivência(%) Início do tratamento adequado Adaptado de Kumar et al., 2006 Tubo para hemocultura, 1915 Tubo para hemocultura, século 21 Hemocultura: 100 anos 3 – 5 dias 50% negativo 7,6% / hr
  58. 58. OBJETIVO GERAL ENRIQUECIMENTO DETECÇÃO e IDENTIFICAÇÃO Captura Seletiva PCR-Array Multiteste molecular - Especificidade - Sensibilidade - Agilidade
  59. 59. Captura Seletiva 105 102 100M + Sangue contaminado artificialmente: P. aeruginosa
  60. 60. In-Check: Plataforma Lab-On-Chip (LOC) Tecnologia: PCR-Array
  61. 61. PCR chips
  62. 62. Tempo do teste a partir de amostras de DNA extraído Nossa Proposta Tempo total do teste: 2h Coleta de sangue Captura Detecção e identificação 5 min 25 min Extração DNA 30 min 60 min
  63. 63. Point of care • Diagnostics • Home care • Insulin pumps
  64. 64. Eyenetra (oftalmologista portátil)
  65. 65. Point of Care • Glaucoma
  66. 66. Colaboradores IBMP/ICC Marco A. Krieger Rita Rampazzo Tahiana Brandalize Camila B. Suarez Cheysa A. Biondo Leonardo Foti ICC Christian Probst Daniela P. Pavoni BioManguinhos Antonio G. P. Ferreira Patricia Brindeiro Edimilson D. Silva UFRJ - Biologia Rodrigo Brindeiro STMicroelectronics Marco Bianchessi Marco de Fazio Marco Cereda Alessandro Cocci ENAS/Fraunhofer Thomas Gessner Andreas Morschauser Jorg Nestler CEA/Leti Guillaume Delapierre Dorothée Jary Justine Lemonnier UFPR – Física Cyro K. Saul Wido H. Schereiner Arandi G. Bezerra Júnior UTFPR Fábio K. Schneider Hugo Vieira Neto UNICAMP Jacobus Swart Fundação CERTI (Florianópolis) Manuel Steidle Daniel Cobra
  67. 67. Obrigado pela atenção! Alexandre Dias T. Costa Instituto Carlos Chagas (ICC) Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP) FIOCRUZ PARANÁ – adcosta@tecpar.br http://www.fiocruz.br/icc/ http://www.ibmp.org.br/

×