Citometria de fluxo aula prática

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  • QUANDO A CÉLULA CRUZA O LASER OCORRE DISPERSÃO DA LUZ PARA TODOS OS LADOS, MAS SÓ EM DUAS DIREÇÕES ELA É ANALISADA:
    A REFRAÇÃO DA LUZ NO ÂNGULO DE 950 É DENOMINADA ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL E REVELA A COMPLEXIDADE DO CONTEÚDO CITOPLASMATICO.
    A REFLEXÃO DA LUZ NA FAIXA DE 1 A 50 FORMA O ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL E REVELA O VOLUME DA CÉLULA.
  • Citometria de fluxo aula prática

    1. 1. CITOMETRIA DE FLUXO Aplicações práticas Patrícia Cisneiros dos Santos Bióloga- UCSAL Mestranda do curso de Imunologia-UFBa
    2. 2. PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CITOMETRIA DE FLUXO CITO Célula METRIA Medida FLUXO Movimento Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
    3. 3. ANTICORPOS MONOCLONAIS
    4. 4. ANTICORPOS MONOCLONAIS
    5. 5. CITÔMETRO DE FLUXO CITÔMETRO DE FLUXO SISTEMA FLUIDO SISTEMA ÓTICO SISTEMA ELETRÔNICO
    6. 6.  SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO  SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ.  SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.
    7. 7. SISTEMA FLUIDO CÂMARA DE FLUXO FOCO DO LASER CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA
    8. 8. FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH ” LOW DIFFERENTIAL PRESSURE HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE High Sample Pressure 60µl/min Low Sample Pressure 12µl/min Laminar Flow Sheath Sheath Sample Laminar Flow Sheath Sample Sheath
    9. 9. SISTEMA ÓPTICO SISTEMA É COMPOSTO POR UM LASER E LENTES PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER. A COLEÇÃO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A DISPERSÃO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA PELAS PARTÍCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE DO LASER. UM SISTEMA DE ESPELHOS ÓPTICOS E FILTROS DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA LUZ PARA OS DETECTORES ÓPTICOS ESPECÍFICOS.
    10. 10. SISTEMA ÓTICO FL1 530/30 FACSCalibur SSC FL2 FL4 488/10 585/42 90/10 Beam Splitter 661/16 DM 560SP DM 640LP 670LP Half Mirror Fluorescence Collection Lens FL3 Beam Combiner 488 nm Blue Laser . Red Diode Laser ~635 nm Flow Flow Cell 488/10 Focusing Lens FSC Diode
    11. 11. Filtros Ópticos – coletar sinais de luz Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu número é deixado passar e menor que seu número é refletido. Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu número é deixado passar e acima de seu número é refletido. Espelhos BP (bandpass) = só deixa passar o comprimento de onda específico. Longpass 460 500 540 Shortpass 460 500 Bandpass 540 460 500 540 Filtro LP 500 SP 500 BP500/30 Detector – célula fotoelétrica
    12. 12. ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC) LASER ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
    13. 13. SISTEMA ELETRÔNICO  CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS, DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM ANALISADOS NO COMPUTADOR.
    14. 14. SISTEMA ELETRÔNICO A medida proveniente de cada detector é denominada Parâmetro • Parâmetro 1 • Parâmetro 2 • Parâmetro 3 • Parâmetro 4 • Parâmetro 5 FSC SSC FL1 FL2 FL3
    15. 15. FLUORESCÊNCIA O que é a fluorescência ? Comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da luz do laser λ = 480 nm O H Fluoresceína O λ = 530 nm CO2H Luz Incidente de maior energía Fluorocromo Luz Fluorescente emitida de menor energia e maior comprimento de onda
    16. 16. FLUORESCÊNCIAS  O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta luz de comprimento de onda ≅ 530 nm, que corresponde à luz verde.  O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda ≅ 570 nm, o que corresponde à luz laranja.  O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta luz de comprimento de onda ≅ 650 nm, o que corresponde à luz vermelha.
    17. 17. SISTEMA ELETRÔNICO
    18. 18. DISPERSÃO VOLUME (FS) BLASTOS POLIMORFONUCLEARES MONÓCITOS LINFÓCITOS DEBRIS/HEMÁCIAS/PLAQUETAS GRANULOSIDADE (SS)
    19. 19. 400 600 Neutrófilos 200 Monócitos Linfócitos 0 Side Scatter 800 1000 DISPERSÃO: 0 200 400 600 800 Forward Light Scatter 1000
    20. 20. Visão dos dados coletados •DOT PLOT: FSC x SSC FL1 x FL2 1000 1000 400 600 CD4 PE 800 800 600 400 200 200 0 0 0 Side Scatter e 0 200 400 600 800 1000 Forward Light Scatter 200 400 600 CD3 FITC 800 1000
    21. 21. ALGUNS MARCADORES CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos timócitos. CD4- 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticas CD8- 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica. CD19- presente em mais de 95% das células B. CD20- assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do tecido linfóide e sangue periférico. CD45- expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO. CD56- marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou granulócitos.
    22. 22. LEUCEMIAS CD3 CD10 CD3 CD7 CD2 CD7 HLA DR CD20 CD2 CD 42a CD3 CD19 CD 61 CD7 CD5 CD19 CD19 CD56 CD33 CD22 CD13 CD23 CD14 CD26 CD34 CD5 Leucemias mielóides Leucemias Linfociticas ou Enfermidade residual mínima Linfomas e Mielomas
    23. 23. APLICAÇÕES CLÍNICAS - Análise da subpopulação linfocítica - Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas - Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo - Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas - Monitoramento quimioterapêutico / doença residual mínima - Análise de reticulócitos - Diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna - Detecção de anticorpos antiplaquetários - Análise do conteúdo de DNA - Quantificação de células progenitoras (Stem cells) - Avaliação imunológica de paciente transplantado, de infusão linfocitária
    24. 24. OBRIGADA A TODOS! OBRIGADA A TODOS!

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