Este documento descreve os princípios básicos e aplicações da citometria de fluxo. Ele explica como o citômetro de fluxo usa um sistema fluido, óptico e eletrônico para alinhar e analisar células marcadas com fluorocromos, fornecendo informações sobre subpopulações celulares. A citometria de fluxo tem muitas aplicações clínicas, incluindo diagnóstico de leucemias e monitoramento de quimioterapia.
6. SISTEMA
FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS
PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO
SISTEMA
ÓPTICO: GERA E COLETA OS
SINAIS DE LUZ.
SISTEMA
ELETRÔNICO: CONVERTE OS
SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS
ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS
PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.
8. FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH ”
LOW DIFFERENTIAL PRESSURE
HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE
High Sample
Pressure
60µl/min
Low Sample
Pressure
12µl/min
Laminar
Flow
Sheath
Sheath
Sample
Laminar
Flow
Sheath
Sample
Sheath
9. SISTEMA ÓPTICO
SISTEMA É COMPOSTO POR UM LASER E LENTES
PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER.
A COLEÇÃO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A
DISPERSÃO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA
PELAS PARTÍCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE
DO LASER.
UM SISTEMA DE ESPELHOS ÓPTICOS E FILTROS
DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA
LUZ PARA OS DETECTORES ÓPTICOS ESPECÍFICOS.
11. Filtros Ópticos – coletar sinais de luz
Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu
número é deixado passar e menor que seu número é refletido.
Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu
número é deixado passar e acima de seu número é refletido.
Espelhos BP (bandpass) = só deixa passar o comprimento de onda
específico.
Longpass
460
500
540
Shortpass
460
500
Bandpass
540
460
500
540
Filtro
LP 500
SP 500
BP500/30
Detector – célula
fotoelétrica
13. SISTEMA ELETRÔNICO
CONVERTE
OS SINAIS ÓPTICOS EM
SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS,
DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM
ANALISADOS NO COMPUTADOR.
14. SISTEMA ELETRÔNICO
A medida proveniente de cada detector é
denominada Parâmetro
• Parâmetro 1
• Parâmetro 2
• Parâmetro 3
• Parâmetro 4
• Parâmetro 5
FSC
SSC
FL1
FL2
FL3
15. FLUORESCÊNCIA
O que é a fluorescência ?
Comprimento de onda gerado pela excitação dos
fluorocromos, após atingir a absorção máxima da
luz do laser
λ = 480 nm
O
H
Fluoresceína
O
λ = 530 nm
CO2H
Luz Incidente de
maior energía
Fluorocromo
Luz Fluorescente emitida
de menor energia e maior
comprimento de onda
16. FLUORESCÊNCIAS
O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta
luz de comprimento de onda ≅ 530 nm, que
corresponde à luz verde.
O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta
luz de comprimento de onda ≅ 570 nm, o que
corresponde à luz laranja.
O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta
luz de comprimento de onda ≅ 650 nm, o que
corresponde à luz vermelha.
20. Visão dos dados coletados
•DOT PLOT: FSC x SSC
FL1 x FL2
1000
1000
400
600
CD4 PE
800
800
600
400
200
200
0
0
0
Side Scatter
e
0
200
400
600
800 1000
Forward Light Scatter
200
400
600
CD3 FITC
800
1000
21. ALGUNS MARCADORES
CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos
timócitos.
CD4- 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo
auxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticas
CD8- 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica.
CD19- presente em mais de 95% das células B.
CD20- assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do
tecido linfóide e sangue periférico.
CD45- expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo
apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO.
CD56- marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou
granulócitos.
23. APLICAÇÕES CLÍNICAS
- Análise da subpopulação linfocítica
- Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas
- Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo
- Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas
- Monitoramento quimioterapêutico / doença residual mínima
- Análise de reticulócitos
- Diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna
- Detecção de anticorpos antiplaquetários
- Análise do conteúdo de DNA
- Quantificação de células progenitoras (Stem cells)
- Avaliação imunológica de paciente transplantado, de infusão
linfocitária
QUANDO A CÉLULA CRUZA O LASER OCORRE DISPERSÃO DA LUZ PARA TODOS OS LADOS, MAS SÓ EM DUAS DIREÇÕES ELA É ANALISADA:
A REFRAÇÃO DA LUZ NO ÂNGULO DE 950 É DENOMINADA ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL E REVELA A COMPLEXIDADE DO CONTEÚDO CITOPLASMATICO.
A REFLEXÃO DA LUZ NA FAIXA DE 1 A 50 FORMA O ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL E REVELA O VOLUME DA CÉLULA.