ICSA29 - Métodos de avaliação da resposta imune celular

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ICSA29 - Métodos de avaliação da resposta imune celular

  1. 1. METODOLOGIAS PARA AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE CELULAR Salvador – BA Julho - 2013
  2. 2. Linf B Linf TCD4+ Linf TCD8+ (Linf. TH) (Linf. TC) Reconhecimento de Antígenos pelos Linfócitos B e T
  3. 3. Métodos para Detecção e Quantificação de Linfócitos • Citometria de Fluxo: baseada em anticorpos monoclonais específicos para cada tipo de marcador celular • Kits específicos para CD3, CD4 e CD8 • Análise espécie-específica • Quantitativo total / relativo • CD4/CD8
  4. 4. Detector de dispersão de luz em ângulo de 90º Complexidade celular SSC (Side Scatter) Detector de dispersão de luz frontal Tamanho celular FSC (Forward Scatter) Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm
  5. 5. ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC) ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC) LASER CÉLULA
  6. 6. 3)Dispersão lateral de luz 1)Suspensão de células Laser 3)Dispersão de luz para a frente 4)Filtro 6) Análise de dados 5)A luz refletida passa através de filtros e é detectada por tubos fotomultiplicadores que convertem o sinal luminoso em sinal eletrônico 2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula
  7. 7. Linfócito TCD4 Anticorpos monoclonais marcados Linfócito TCD8 Citometria de fluxo Luz fluorescente Laser Contagem das células
  8. 8. Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal) Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro. Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmente Os círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos
  9. 9. Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência) Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3- Neste quadrante estão as células CD4- e CD3- (células que não linfócitos) Neste quadrante estão as células CD4- e CD3+ (outros linfócitos que não Th) Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3+ (linfócitos Th)
  10. 10. Metodologia para quantificação de linfócitos - Citometria Bismarck et al. 2012. Canine CD4+CD8+ double positive T cells in peripheral blood have features of activated T cells. Veterinary Immunology and Immunopathology
  11. 11. Metodologia para quantificação de linfócitos - Citometria Bismarck et al. 2012. Canine CD4+CD8+ double positive T cells in peripheral blood have features of activated T cells. Veterinary Immunology and Immunopathology
  12. 12. Vias de Transdução do Sinal - Linf. T
  13. 13. Métodos para Avaliação de Transdução de Sinal • Western Blot – anticorpos específicos para cada molécula participante de cada cadeia de transdução de sinal • Anticorpos específicos para mediadores fosforilados e não fosforilados • Tempo dependentes e dose dependentes • Controles internos e externos importante
  14. 14. Métodos para Avaliação de Transdução de Sinal Andrade et al. 2004. The vaccinia virus-stimulated mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is required for virus multiplication. Biochemistry Journal
  15. 15. Métodos para Avaliação de Transdução de Sinal Campos et al. 2004. Impaired production of proinflammatory cytokines and host resistance to acute infection with Trypanosoma cruzi in mice lacking functional myeloid differentiation factor 88. Journal of Immunology.
  16. 16. L-selectinas e adressinas dirigem os linfócitos para os tecidos linfoides
  17. 17. Integrinas são importantes na adesão leucocitária
  18. 18. Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão • Imunohistoquímica, Imunofluorescência Indireta – avaliação qualitativa e semi- quantitativa da expressão de moléculas de adesão em diferentes órgãos • Avaliação in vivo, ex-vivo, biópsias, cortes histológicos • Citometria de Fluxo – avaliação in vitro, células cultivadas, ex-vivo – marcadores específicos
  19. 19. Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão Subranamian et al. 2012. Signaling through L-selectin mediates enhanced chemotaxis of lymphocyte subsets to secondary lymphoid tissue chemokine. Journal of Immunology.
  20. 20. Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão Shetty et al. 2012. Recruitment mechanisms of primary and malignant B cells to the human liver. Hepatology.
  21. 21. Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão Shetty et al. 2012. Recruitment mechanisms of primary and malignant B cells to the human liver. Hepatology.
  22. 22. Caracteristicas gerais
  23. 23. Métodos de dosagem de citocinas • ELISA Sanduíche – a partir de sobrenadante de células em cultivo após diferentes estímulos – citocinas secretadas • Citometria de Fluxo – beads contendo anticorpos específicos contra citocinas • Citometria de Fluxo – citocinas intracitoplasmáticas, contagem do número de células produtoras – efeito celular
  24. 24. Métodos de dosagem de citocinas • ELISPOT – metodologia que permite acompanhar a cinética de células estimuladas quanto à sua produção de citocinas específicas em cultivo • Através de visualização em microscópio, conta-se o número de células marcadas.
  25. 25. ELISPOT
  26. 26. ELISPOT
  27. 27. Métodos de dosagem de citocinas Arrode-Brusés et al. 2012. Immunogenicity of a lentiviral-based DNA vaccine driven by the 5'LTR of the naturally attenuated caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in mice and macaques. Vaccine
  28. 28. Métodos de dosagem de citocinas Arrode-Brusés et al. 2012. Immunogenicity of a lentiviral-based DNA vaccine driven by the 5'LTR of the naturally attenuated caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in mice and macaques. Vaccine
  29. 29. Métodos de dosagem de citocinas Arrode-Brusés et al. 2012. Immunogenicity of a lentiviral-based DNA vaccine driven by the 5'LTR of the naturally attenuated caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in mice and macaques. Vaccine
  30. 30. Detecção da Hipersensibilidade Tipo I • O teste cutâneo determina a capacidade de diferentes alérgenos de produzirem uma reação de pápula e eritema . aspecto de uma reação após 5 horas aspecto de uma reação logo após injeção alérgeno diluído de 1:10 até 1:1000
  31. 31. Teste Radioalergoadsorvente(RAST) Mede o nível sérico de anticorpos IgE específicos contra determinado componente alergênico ao paciente. discos com componente alergênico suspeito soro do paciente contendo anti-alérgeno IgE lavagem adição de anti IgE humana marcada lavagem detecção
  32. 32. IMUNOFLUORESCÊNCIA DE REAÇÕES DE HIPERSENSIBILIDADE TIPOS II E III TIPO III TIPO II Os cortes de rim comparam o padrão de imunofluorescência de um paciente com Lupus Eritematoso Sistêmico (predomínio de hipersensibilidade tipo III) e um paciente com Síndrome de Goodpasture (predomínio de hipersensibilidade tipo II). No LES, os imunocomplexos formados no sangue são depositados no tecido renal, dando aspecto granular. No segundo caso, os anticorpos se depositam de forma linear sobre a membrana basal glomerular.
  33. 33. Detecção da Hipersensibilidade Tipo IV Testes cutâneos No teste epicutâneo - aplica-se uma baixa dose do antígeno suspeito numa área da pele do paciente . Pode haver desenvolvimento de eczema dentro de 48 a 72 h. EPIDERME DERME GORDURA SUBCUTÂNEA Antígeno
  34. 34. EPIDERME DERME GORDURA SUBCUTÂNEA •Teste tuberculínico – o derivado protéico purificado de Mycobacterium tuberculosis, PPD, é injetado por via intradérmica. Nesse teste analisa-se o surgimento de vermelhidão e enduração no local da injeção, que podem surgir depois de 24 a 72h em indivíduos pré-sensibilizados.
  35. 35. APRESENTAÇÃO CLÍNICA E HISTOLÓGICA DO TESTE TUBERCULÍNICO Resposta ao teste: 1. nenhuma reação: normal 2. 5 a 10mm: repetir o exame 3. > 10mm: positivo para tuberculose 4. Paciente HIV +, >5mm: positivo para tuberculose
  36. 36. Avaliação da produção de IFN- (por exemplo, em paciente suspeito de infeccão por Mybacterium tuberculosis) Suspeito Controles negativo e positivo Cultura de sangue total Sangue + PPD Coleta do sobrenadante ELISA detecção de IFN- 24 h Leitura de densidade óptica sangue Avaliação dos resultados
  37. 37. Métodos de Avaliação da Resposta Imune Celular
  38. 38. ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS
  39. 39. ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS
  40. 40. Lim et al 2009.The Effects of Heat-Killed Wild-Type Lactobacillus casei Shirota on Allergic Immune Responses in an Allergy Mouse Model. International Archives of Allergy and Immunology, ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS

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