O documento descreve metodologias para avaliação da resposta imune celular, incluindo citometria de fluxo para quantificação e caracterização de linfócitos, métodos para avaliação de transdução de sinal, moléculas de adesão e produção de citocinas.

1. METODOLOGIAS PARA AVALIAÇÃO
DA RESPOSTA IMUNE CELULAR
Salvador – BA
Julho - 2013

2. Linf B Linf TCD4+ Linf TCD8+
(Linf. TH) (Linf. TC)
Reconhecimento de Antígenos pelos
Linfócitos B e T

3. Métodos para Detecção e
Quantificação de Linfócitos
• Citometria de Fluxo: baseada em anticorpos
monoclonais específicos para cada tipo de
marcador celular
• Kits específicos para CD3, CD4 e CD8
• Análise espécie-específica
• Quantitativo total / relativo
• CD4/CD8

4. Detector de dispersão de
luz em ângulo de 90º
Complexidade celular
SSC (Side Scatter)
Detector de dispersão de
luz frontal
Tamanho celular
FSC (Forward Scatter)
Fonte de Luz Incidente: Laser
de Argon a 488 nm

5. ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
LASER
CÉLULA

6. 3)Dispersão lateral
de luz
1)Suspensão de células
Laser
3)Dispersão de luz
para a frente
4)Filtro
6) Análise
de dados
5)A luz refletida passa
através de filtros e é
detectada por tubos
fotomultiplicadores que
convertem o sinal luminoso
em sinal eletrônico
2) Anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma
célula

7. Linfócito TCD4
Anticorpos monoclonais marcados
Linfócito TCD8
Citometria de fluxo
Luz fluorescente
Laser
Contagem das
células

8. Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal)
Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro.
Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente
E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmente
Os círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos

9. Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência)
Neste quadrante estão as
células CD4+ e CD3-
Neste quadrante estão as
células CD4- e CD3-
(células que não linfócitos)
Neste quadrante estão as
células CD4- e CD3+
(outros linfócitos que não Th)
Neste quadrante estão as
células CD4+ e CD3+
(linfócitos Th)

10. Metodologia para quantificação de
linfócitos - Citometria
Bismarck et al. 2012. Canine CD4+CD8+ double positive T cells in peripheral blood have
features of activated T cells. Veterinary Immunology and Immunopathology

11. Metodologia para quantificação de
linfócitos - Citometria
Bismarck et al. 2012. Canine CD4+CD8+ double positive T cells in peripheral blood have
features of activated T cells. Veterinary Immunology and Immunopathology

12. Vias de
Transdução
do Sinal -
Linf. T

13. Métodos para Avaliação
de Transdução de Sinal
• Western Blot – anticorpos específicos para
cada molécula participante de cada cadeia de
transdução de sinal
• Anticorpos específicos para mediadores
fosforilados e não fosforilados
• Tempo dependentes e dose dependentes
• Controles internos e externos importante

14. Métodos para Avaliação
de Transdução de Sinal
Andrade et al. 2004. The vaccinia virus-stimulated mitogen-activated protein kinase (MAPK)
pathway is required for virus multiplication. Biochemistry Journal

15. Métodos para Avaliação
de Transdução de Sinal
Campos et al. 2004. Impaired production of proinflammatory cytokines and host resistance to
acute infection with Trypanosoma cruzi in mice lacking functional myeloid differentiation factor 88.
Journal of Immunology.

16. L-selectinas e
adressinas
dirigem os linfócitos
para os tecidos
linfoides

17. Integrinas são importantes
na adesão leucocitária

19. Métodos para avaliação de
Moléculas de Adesão
• Imunohistoquímica, Imunofluorescência
Indireta – avaliação qualitativa e semi-
quantitativa da expressão de moléculas de
adesão em diferentes órgãos
• Avaliação in vivo, ex-vivo, biópsias, cortes
histológicos
• Citometria de Fluxo – avaliação in vitro,
células cultivadas, ex-vivo – marcadores
específicos

20. Métodos para avaliação de
Moléculas de Adesão
Subranamian et al. 2012. Signaling through L-selectin mediates enhanced chemotaxis of
lymphocyte subsets to secondary lymphoid tissue chemokine. Journal of Immunology.

21. Métodos para avaliação de
Moléculas de Adesão
Shetty et al. 2012. Recruitment mechanisms of primary and malignant B cells to the human liver.
Hepatology.

22. Métodos para avaliação de
Moléculas de Adesão
Shetty et al. 2012. Recruitment mechanisms of primary and malignant B cells to the human liver.
Hepatology.

23. Caracteristicas
gerais

26. Métodos de dosagem de citocinas
• ELISA Sanduíche – a partir de sobrenadante de
células em cultivo após diferentes estímulos –
citocinas secretadas
• Citometria de Fluxo – beads contendo
anticorpos específicos contra citocinas
• Citometria de Fluxo – citocinas
intracitoplasmáticas, contagem do número de
células produtoras – efeito celular

27. Métodos de dosagem de citocinas
• ELISPOT – metodologia que permite
acompanhar a cinética de células estimuladas
quanto à sua produção de citocinas
específicas em cultivo
• Através de visualização em microscópio,
conta-se o número de células marcadas.

28. ELISPOT

30. ELISPOT

31. Métodos de dosagem de citocinas
Arrode-Brusés et al. 2012. Immunogenicity of a lentiviral-based DNA vaccine driven by
the 5'LTR of the naturally attenuated caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in mice
and macaques. Vaccine

32. Métodos de dosagem de citocinas
Arrode-Brusés et al. 2012. Immunogenicity of a lentiviral-based DNA vaccine driven by
the 5'LTR of the naturally attenuated caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in mice
and macaques. Vaccine

33. Métodos de dosagem de citocinas
Arrode-Brusés et al. 2012. Immunogenicity of a lentiviral-based DNA vaccine driven by
the 5'LTR of the naturally attenuated caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in mice
and macaques. Vaccine

34. Detecção da Hipersensibilidade
Tipo I
• O teste
cutâneo
determina a
capacidade
de diferentes
alérgenos de
produzirem
uma reação
de pápula e
eritema .
aspecto de uma reação
após 5 horas
aspecto de uma reação
logo após injeção
alérgeno diluído
de 1:10 até 1:1000

35. Teste Radioalergoadsorvente(RAST)
Mede o nível sérico de anticorpos IgE específicos contra determinado
componente alergênico ao paciente.
discos com
componente
alergênico
suspeito
soro do paciente contendo
anti-alérgeno IgE
lavagem
adição de anti IgE humana
marcada
lavagem detecção

36. IMUNOFLUORESCÊNCIA DE REAÇÕES DE
HIPERSENSIBILIDADE TIPOS II E III
TIPO III TIPO II
Os cortes de rim comparam o
padrão de imunofluorescência de
um paciente com Lupus Eritematoso
Sistêmico (predomínio de
hipersensibilidade tipo III) e um
paciente com Síndrome de
Goodpasture (predomínio de
hipersensibilidade tipo II). No LES,
os imunocomplexos formados no
sangue são depositados no tecido
renal, dando aspecto granular. No
segundo caso, os anticorpos se
depositam de forma linear sobre a
membrana basal glomerular.

37. Detecção da Hipersensibilidade
Tipo IV
Testes cutâneos
No teste epicutâneo - aplica-se uma baixa dose do antígeno suspeito numa área da pele
do paciente .
Pode haver desenvolvimento de eczema dentro de 48 a 72 h.
EPIDERME
DERME
GORDURA
SUBCUTÂNEA
Antígeno

38. EPIDERME
DERME
GORDURA
SUBCUTÂNEA
•Teste tuberculínico – o derivado protéico purificado de Mycobacterium
tuberculosis, PPD, é injetado por via intradérmica.
Nesse teste analisa-se o surgimento de vermelhidão e enduração no local da
injeção, que podem surgir depois de 24 a 72h em indivíduos pré-sensibilizados.

39. APRESENTAÇÃO CLÍNICA E HISTOLÓGICA DO
TESTE TUBERCULÍNICO
Resposta ao teste:
1. nenhuma reação:
normal
2. 5 a 10mm: repetir o
exame
3. > 10mm: positivo para
tuberculose
4. Paciente HIV +, >5mm:
positivo para
tuberculose

40. Avaliação da produção de IFN-
(por exemplo, em paciente suspeito de infeccão por Mybacterium tuberculosis)
Suspeito
Controles
negativo
e positivo
Cultura
de
sangue total
Sangue
+
PPD
Coleta
do
sobrenadante
ELISA
detecção
de IFN-
24 h
Leitura
de
densidade
óptica
sangue
Avaliação dos resultados

43. Métodos de Avaliação da
Resposta Imune Celular

44. ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS

45. ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS

46. Lim et al 2009.The Effects of Heat-Killed Wild-Type Lactobacillus casei Shirota on Allergic Immune
Responses in an Allergy Mouse Model. International Archives of Allergy and Immunology,
ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS