PCR: sua principal função, os principais reagentes e suas funções e os pontos importantes que levam a falha no resultado final da PCR.

1. Universidade de Pernambuco – UPE
Laboratório de Resistência Microbiana- LRM
PCR-REAÇÃO EM CADEIA PELA
DNA POLIMERASE
HEMILLY RAYANNE F. SILVA

2. HISTÓRICO
• 1987 - O processo de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, do
inglês Polymerase Chain Reaction) foi descrito por Kary Mullis;
• 1989 - A Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este
processo;
• 1993 - K. Mullis recebeu o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho.

3. O QUE É A REAÇÃO EM CADEIA PELA
DNA POLIMERASE?

4. OBJETIVO DA PCR
É a obtenção de muitas cópias de uma sequência
específica de ácido nucléico, a partir de uma fita
molde, ou seja, consiste na produção de DNA, in
vitro.

5. COMO É FEITO?
Em primeiro lugar, deve-se extrair o material
genético(DNA) da célula ou outro material a ser
estudado.

6. COMO É FEITO?

7. REAGENTES PARA A REAÇÃO
• DNA-POLIMERASE: A mais usada é a taq-polimerase; É a
catalisadora da extensão dos primers; Aumento na sua
concentração pode resultar na diminuição da sua
especificidade;
• SOLUÇÃO TAMPÃO: Basicamente esta solução contém íons
diversos (Na⁺, Cl⁻,K⁺ entre outros) que otimizam as condições
da reação;

8. REAGENTES PARA A REAÇÃO
• MgCl₂: Doador muito estável de íons Mg²⁺, que são
cofatores indispensáveis para a atividade da enzima;
• dNTP : Desequilíbrio da misturas de dNTP reduz a fidelidade
da Taq. O dNTP reduz o Mg²⁺ livre, interferindo assim com a
atividade da polimerase e diminuindo o anelamento do
primer.

9. REAGENTES PARA A REAÇÃO
COMO ESCOLHER O
PRIMER?

10. PRIMER/INICIADOR
• Sintetizados quimicamente;
• 15 a 25 bases ;
• Define limites alvo a amplificar;
• Serve como ponto de início para a replicação;
• Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duas
direções (para frente e para trás);
• Banco de Dados International Nucleotide Sequence Database
(www.insdc.org)
• GenBank (NCBI, NIH) European Molecular Biology Laborstory
(EMBL) DNA DataBank of Japan (DDBJ)

11. COMO É FEITO?
Coloca-se o microtubo de ensaio em uma máquina
termocicladora que possui como função fazer ciclos
de temperaturas pré-estabelecidos com tempos
exatos específicos para as reações seguintes da
análise.

12. COMO É FEITO?

13. ETAPAS DO CICLO
• 1- DESNATURAÇÃO: É muito importante para que a fita do
DNA molde alvo se separem; Inicialmente o termociclador irá
elevar a temperatura da mistura de 92 a 96 ºC o que irá
promover a separação da fita dupla de DNA em duas fitas
simples através da quebra das pontes de hidrogênio.
5’ 3’
3’ 5’
92C
5’ 3’
+
3’ 5’

14. ETAPAS DO CICLO
• 2-Anelamento: Cada fita simples do DNA que foi
desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias
complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers
se anelam as duas fitas simples, servindo de iniciadores para a
enzima polimerase.
5’ 3’
Forward primer Reverse primer
3’ 5’

15. ETAPAS DO CICLO
• 3-Extensão:Aquece-se novamente o tubo a 72ºC
(temperatura ideal de funcionamento da Taq polimerase) para
a duplicação da fita. A Taq polimerase inicia, após o final do
primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA
ligando-os por complementaridade, formando assim uma
nova fita dupla.

16. PRODUTO FINAL DA PCR
• DNA primeira copia
• PCR

21. DETECÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR
Finalizada a PCR o próximo passo é detectar a presença de
produtos amplificados; Em geral isso é realizado pela
eletroforese em gel de agarose ou acrilamida.

22. PCR
PONTOS IMPORTANTES
PARA O BOM
FUNCIONAMENTO DA
PCR

23. PONTOS IMPORTANTES:
• Concentrações de “primers” entre 0,1 e 0,5ϻM são geralmente ótimas.
Concentrações mais altas podem resultar em acúmulo de produtos não
específicos, reduzindo a concentração do produto desejado.
Concentrações mais baixas podem ser esgotadas previamente ao final da
reação, resultando em baixa concentração do produto desejado;
• A temperatura de anelamento depende do comprimento e composição
dos primers. Uma temperatura de anelamento baixa demais resulta em
anelamento não-específico e, portanto, amplificação não-espeífica.
Enquanto, que uma temperatura muito alta resulta numa reduzida
concentração do produto.

24. PONTOS IMPORTANTES:
• Para o sucesso da PCR, a seqüência gênica a ser amplificada deve estar
intacta. Uma qualidade pobre de DNA, irá frequentemente conter
iniciadores que deveriam ser desenhados para amplificar regiões curtas
dentro do molde;
• A proporção iniciador/molde influencia significantemente a PCR e deveria
ser otimizada empiricamente. Baixa concentração de DNA é necessária para
uma PCR ótima;
• Tipicamente, menos de 0,2ϻg de DNA pode ser suficientemente
amplificado em 30 ciclos. A pureza do molde também influencia no
resultado da reação.

25. PCR
APARECIMENTO DE
BANDAS INESPECÍFICAS
NA PCR O QUE FAZER?

26. SUGESTÃO
• Reduza a quantidade de DNA;
• Diminuir o tempo de anelamento da reação;
• Aumente a temperatura de anelamento;
• Reduza a concentração da enzima;
• Reduza a concentração de Mg²⁺;
• Aumento do tempo de desnaturação;
• Aumento da temperatura de desnaturação;
• Reduza o tempo de extensão;
• Reveja os desenhos dos primers.

27. BANDAS INESPECÍFICAS

28. PCR
A REAÇÃO ESTAVA
FUNCIONANDO ANTES,
MAS AGORA EU NÃO
OBTENHO NENHUM
PRODUTO. O QUE FAZER?

29. SUGESTÃO
• Tenha certeza que todos os componentes estão na reação
(tampão, DNA, primers…);
• Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP
(são sensíveis a descongelamentos consecutivos);
• Utilize um estoque novo de primers;
• Diminua sua temperatura de anelamento,se não obtiver
nenhum fragmento verifique todas os componentes.

30. VANTAGENS DA TÉCNICA
• Capacidade de amplificar uma sequência precisa de
DNA;
• Rápida;
• De baixo custo;

31. LIMITAÇÕES
• Necessidade de conhecer a sequência de DNA a
amplificar para que possam ser
sintetizados primers específicos;
• Facilidade de contaminação da amostra;
• Extensão limitada da sequência a se amplificar;
• Limitada extensão da sequência;
• Incorporação errônea de bases durante a
replicação.

32. PRINCIPAIS USO DA PCR