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Universidade de Pernambuco – UPE 
Laboratório de Resistência Microbiana- LRM 
PCR-REAÇÃO EM CADEIA PELA 
DNA POLIMERASE 
HEMILLY RAYANNE F. SILVA
HISTÓRICO 
• 1987 - O processo de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, do 
inglês Polymerase Chain Reaction) foi descrito por Kary Mullis; 
• 1989 - A Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este 
processo; 
• 1993 - K. Mullis recebeu o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho.
O QUE É A REAÇÃO EM CADEIA PELA 
DNA POLIMERASE?
OBJETIVO DA PCR 
É a obtenção de muitas cópias de uma sequência 
específica de ácido nucléico, a partir de uma fita 
molde, ou seja, consiste na produção de DNA, in 
vitro.
COMO É FEITO? 
Em primeiro lugar, deve-se extrair o material 
genético(DNA) da célula ou outro material a ser 
estudado.
COMO É FEITO?
REAGENTES PARA A REAÇÃO 
• DNA-POLIMERASE: A mais usada é a taq-polimerase; É a 
catalisadora da extensão dos primers; Aumento na sua 
concentração pode resultar na diminuição da sua 
especificidade; 
• SOLUÇÃO TAMPÃO: Basicamente esta solução contém íons 
diversos (Na⁺, Cl⁻,K⁺ entre outros) que otimizam as condições 
da reação;
REAGENTES PARA A REAÇÃO 
• MgCl₂: Doador muito estável de íons Mg²⁺, que são 
cofatores indispensáveis para a atividade da enzima; 
• dNTP : Desequilíbrio da misturas de dNTP reduz a fidelidade 
da Taq. O dNTP reduz o Mg²⁺ livre, interferindo assim com a 
atividade da polimerase e diminuindo o anelamento do 
primer.
REAGENTES PARA A REAÇÃO 
COMO ESCOLHER O 
PRIMER?
PRIMER/INICIADOR 
• Sintetizados quimicamente; 
• 15 a 25 bases ; 
• Define limites alvo a amplificar; 
• Serve como ponto de início para a replicação; 
• Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duas 
direções (para frente e para trás); 
• Banco de Dados International Nucleotide Sequence Database 
(www.insdc.org) 
• GenBank (NCBI, NIH) European Molecular Biology Laborstory 
(EMBL) DNA DataBank of Japan (DDBJ)
COMO É FEITO? 
Coloca-se o microtubo de ensaio em uma máquina 
termocicladora que possui como função fazer ciclos 
de temperaturas pré-estabelecidos com tempos 
exatos específicos para as reações seguintes da 
análise.
COMO É FEITO?
ETAPAS DO CICLO 
• 1- DESNATURAÇÃO: É muito importante para que a fita do 
DNA molde alvo se separem; Inicialmente o termociclador irá 
elevar a temperatura da mistura de 92 a 96 ºC o que irá 
promover a separação da fita dupla de DNA em duas fitas 
simples através da quebra das pontes de hidrogênio. 
5’ 3’ 
3’ 5’ 
92C 
5’ 3’ 
+ 
3’ 5’
ETAPAS DO CICLO 
• 2-Anelamento: Cada fita simples do DNA que foi 
desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias 
complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers 
se anelam as duas fitas simples, servindo de iniciadores para a 
enzima polimerase. 
5’ 3’ 
Forward primer Reverse primer 
3’ 5’
ETAPAS DO CICLO 
• 3-Extensão:Aquece-se novamente o tubo a 72ºC 
(temperatura ideal de funcionamento da Taq polimerase) para 
a duplicação da fita. A Taq polimerase inicia, após o final do 
primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA 
ligando-os por complementaridade, formando assim uma 
nova fita dupla.
PRODUTO FINAL DA PCR 
• DNA primeira copia 
• PCR
DETECÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR 
Finalizada a PCR o próximo passo é detectar a presença de 
produtos amplificados; Em geral isso é realizado pela 
eletroforese em gel de agarose ou acrilamida.
PCR 
PONTOS IMPORTANTES 
PARA O BOM 
FUNCIONAMENTO DA 
PCR
PONTOS IMPORTANTES: 
• Concentrações de “primers” entre 0,1 e 0,5ϻM são geralmente ótimas. 
Concentrações mais altas podem resultar em acúmulo de produtos não 
específicos, reduzindo a concentração do produto desejado. 
Concentrações mais baixas podem ser esgotadas previamente ao final da 
reação, resultando em baixa concentração do produto desejado; 
• A temperatura de anelamento depende do comprimento e composição 
dos primers. Uma temperatura de anelamento baixa demais resulta em 
anelamento não-específico e, portanto, amplificação não-espeífica. 
Enquanto, que uma temperatura muito alta resulta numa reduzida 
concentração do produto.
PONTOS IMPORTANTES: 
• Para o sucesso da PCR, a seqüência gênica a ser amplificada deve estar 
intacta. Uma qualidade pobre de DNA, irá frequentemente conter 
iniciadores que deveriam ser desenhados para amplificar regiões curtas 
dentro do molde; 
• A proporção iniciador/molde influencia significantemente a PCR e deveria 
ser otimizada empiricamente. Baixa concentração de DNA é necessária para 
uma PCR ótima; 
• Tipicamente, menos de 0,2ϻg de DNA pode ser suficientemente 
amplificado em 30 ciclos. A pureza do molde também influencia no 
resultado da reação.
PCR 
APARECIMENTO DE 
BANDAS INESPECÍFICAS 
NA PCR O QUE FAZER?
SUGESTÃO 
• Reduza a quantidade de DNA; 
• Diminuir o tempo de anelamento da reação; 
• Aumente a temperatura de anelamento; 
• Reduza a concentração da enzima; 
• Reduza a concentração de Mg²⁺; 
• Aumento do tempo de desnaturação; 
• Aumento da temperatura de desnaturação; 
• Reduza o tempo de extensão; 
• Reveja os desenhos dos primers.
BANDAS INESPECÍFICAS
PCR 
A REAÇÃO ESTAVA 
FUNCIONANDO ANTES, 
MAS AGORA EU NÃO 
OBTENHO NENHUM 
PRODUTO. O QUE FAZER?
SUGESTÃO 
• Tenha certeza que todos os componentes estão na reação 
(tampão, DNA, primers…); 
• Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP 
(são sensíveis a descongelamentos consecutivos); 
• Utilize um estoque novo de primers; 
• Diminua sua temperatura de anelamento,se não obtiver 
nenhum fragmento verifique todas os componentes.
VANTAGENS DA TÉCNICA 
• Capacidade de amplificar uma sequência precisa de 
DNA; 
• Rápida; 
• De baixo custo;
LIMITAÇÕES 
• Necessidade de conhecer a sequência de DNA a 
amplificar para que possam ser 
sintetizados primers específicos; 
• Facilidade de contaminação da amostra; 
• Extensão limitada da sequência a se amplificar; 
• Limitada extensão da sequência; 
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replicação.
PRINCIPAIS USO DA PCR
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PCR- Reação em cadeia pela DNA POLIMERASE!

  • 1. Universidade de Pernambuco – UPE Laboratório de Resistência Microbiana- LRM PCR-REAÇÃO EM CADEIA PELA DNA POLIMERASE HEMILLY RAYANNE F. SILVA
  • 2. HISTÓRICO • 1987 - O processo de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) foi descrito por Kary Mullis; • 1989 - A Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo; • 1993 - K. Mullis recebeu o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho.
  • 3. O QUE É A REAÇÃO EM CADEIA PELA DNA POLIMERASE?
  • 4. OBJETIVO DA PCR É a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucléico, a partir de uma fita molde, ou seja, consiste na produção de DNA, in vitro.
  • 5. COMO É FEITO? Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético(DNA) da célula ou outro material a ser estudado.
  • 7. REAGENTES PARA A REAÇÃO • DNA-POLIMERASE: A mais usada é a taq-polimerase; É a catalisadora da extensão dos primers; Aumento na sua concentração pode resultar na diminuição da sua especificidade; • SOLUÇÃO TAMPÃO: Basicamente esta solução contém íons diversos (Na⁺, Cl⁻,K⁺ entre outros) que otimizam as condições da reação;
  • 8. REAGENTES PARA A REAÇÃO • MgCl₂: Doador muito estável de íons Mg²⁺, que são cofatores indispensáveis para a atividade da enzima; • dNTP : Desequilíbrio da misturas de dNTP reduz a fidelidade da Taq. O dNTP reduz o Mg²⁺ livre, interferindo assim com a atividade da polimerase e diminuindo o anelamento do primer.
  • 9. REAGENTES PARA A REAÇÃO COMO ESCOLHER O PRIMER?
  • 10. PRIMER/INICIADOR • Sintetizados quimicamente; • 15 a 25 bases ; • Define limites alvo a amplificar; • Serve como ponto de início para a replicação; • Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duas direções (para frente e para trás); • Banco de Dados International Nucleotide Sequence Database (www.insdc.org) • GenBank (NCBI, NIH) European Molecular Biology Laborstory (EMBL) DNA DataBank of Japan (DDBJ)
  • 11. COMO É FEITO? Coloca-se o microtubo de ensaio em uma máquina termocicladora que possui como função fazer ciclos de temperaturas pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para as reações seguintes da análise.
  • 13. ETAPAS DO CICLO • 1- DESNATURAÇÃO: É muito importante para que a fita do DNA molde alvo se separem; Inicialmente o termociclador irá elevar a temperatura da mistura de 92 a 96 ºC o que irá promover a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples através da quebra das pontes de hidrogênio. 5’ 3’ 3’ 5’ 92C 5’ 3’ + 3’ 5’
  • 14. ETAPAS DO CICLO • 2-Anelamento: Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam as duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase. 5’ 3’ Forward primer Reverse primer 3’ 5’
  • 15. ETAPAS DO CICLO • 3-Extensão:Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da Taq polimerase) para a duplicação da fita. A Taq polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla.
  • 16. PRODUTO FINAL DA PCR • DNA primeira copia • PCR
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  • 21. DETECÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR Finalizada a PCR o próximo passo é detectar a presença de produtos amplificados; Em geral isso é realizado pela eletroforese em gel de agarose ou acrilamida.
  • 22. PCR PONTOS IMPORTANTES PARA O BOM FUNCIONAMENTO DA PCR
  • 23. PONTOS IMPORTANTES: • Concentrações de “primers” entre 0,1 e 0,5ϻM são geralmente ótimas. Concentrações mais altas podem resultar em acúmulo de produtos não específicos, reduzindo a concentração do produto desejado. Concentrações mais baixas podem ser esgotadas previamente ao final da reação, resultando em baixa concentração do produto desejado; • A temperatura de anelamento depende do comprimento e composição dos primers. Uma temperatura de anelamento baixa demais resulta em anelamento não-específico e, portanto, amplificação não-espeífica. Enquanto, que uma temperatura muito alta resulta numa reduzida concentração do produto.
  • 24. PONTOS IMPORTANTES: • Para o sucesso da PCR, a seqüência gênica a ser amplificada deve estar intacta. Uma qualidade pobre de DNA, irá frequentemente conter iniciadores que deveriam ser desenhados para amplificar regiões curtas dentro do molde; • A proporção iniciador/molde influencia significantemente a PCR e deveria ser otimizada empiricamente. Baixa concentração de DNA é necessária para uma PCR ótima; • Tipicamente, menos de 0,2ϻg de DNA pode ser suficientemente amplificado em 30 ciclos. A pureza do molde também influencia no resultado da reação.
  • 25. PCR APARECIMENTO DE BANDAS INESPECÍFICAS NA PCR O QUE FAZER?
  • 26. SUGESTÃO • Reduza a quantidade de DNA; • Diminuir o tempo de anelamento da reação; • Aumente a temperatura de anelamento; • Reduza a concentração da enzima; • Reduza a concentração de Mg²⁺; • Aumento do tempo de desnaturação; • Aumento da temperatura de desnaturação; • Reduza o tempo de extensão; • Reveja os desenhos dos primers.
  • 28. PCR A REAÇÃO ESTAVA FUNCIONANDO ANTES, MAS AGORA EU NÃO OBTENHO NENHUM PRODUTO. O QUE FAZER?
  • 29. SUGESTÃO • Tenha certeza que todos os componentes estão na reação (tampão, DNA, primers…); • Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos); • Utilize um estoque novo de primers; • Diminua sua temperatura de anelamento,se não obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.
  • 30. VANTAGENS DA TÉCNICA • Capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA; • Rápida; • De baixo custo;
  • 31. LIMITAÇÕES • Necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers específicos; • Facilidade de contaminação da amostra; • Extensão limitada da sequência a se amplificar; • Limitada extensão da sequência; • Incorporação errônea de bases durante a replicação.