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PCR- Reação em cadeia pela DNA POLIMERASE!
O documento descreve a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), seu histórico, componentes e etapas do processo. A PCR permite a amplificação de sequências específicas de DNA, utilizando primers e uma enzima polimerase, e envolve etapas como desnaturação, anelamento e extensão. Apesar de suas vantagens, a técnica tem limitações, como a necessidade de conhecer a sequência-alvo e a possibilidade de contaminação.
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- 1. Universidade de Pernambuco– UPE Laboratório de Resistência Microbiana- LRM PCR-REAÇÃO EM CADEIA PELA DNA POLIMERASE HEMILLY RAYANNE F. SILVA
- 2. HISTÓRICO • 1987- O processo de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) foi descrito por Kary Mullis; • 1989 - A Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo; • 1993 - K. Mullis recebeu o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho.
- 3. O QUE ÉA REAÇÃO EM CADEIA PELA DNA POLIMERASE?
- 4. OBJETIVO DA PCR É a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucléico, a partir de uma fita molde, ou seja, consiste na produção de DNA, in vitro.
- 5. COMO É FEITO? Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético(DNA) da célula ou outro material a ser estudado.
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- 7. REAGENTES PARA AREAÇÃO • DNA-POLIMERASE: A mais usada é a taq-polimerase; É a catalisadora da extensão dos primers; Aumento na sua concentração pode resultar na diminuição da sua especificidade; • SOLUÇÃO TAMPÃO: Basicamente esta solução contém íons diversos (Na⁺, Cl⁻,K⁺ entre outros) que otimizam as condições da reação;
- 8. REAGENTES PARA AREAÇÃO • MgCl₂: Doador muito estável de íons Mg²⁺, que são cofatores indispensáveis para a atividade da enzima; • dNTP : Desequilíbrio da misturas de dNTP reduz a fidelidade da Taq. O dNTP reduz o Mg²⁺ livre, interferindo assim com a atividade da polimerase e diminuindo o anelamento do primer.
- 9. REAGENTES PARA AREAÇÃO COMO ESCOLHER O PRIMER?
- 10. PRIMER/INICIADOR • Sintetizadosquimicamente; • 15 a 25 bases ; • Define limites alvo a amplificar; • Serve como ponto de início para a replicação; • Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duas direções (para frente e para trás); • Banco de Dados International Nucleotide Sequence Database (www.insdc.org) • GenBank (NCBI, NIH) European Molecular Biology Laborstory (EMBL) DNA DataBank of Japan (DDBJ)
- 11. COMO É FEITO? Coloca-se o microtubo de ensaio em uma máquina termocicladora que possui como função fazer ciclos de temperaturas pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para as reações seguintes da análise.
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- 13. ETAPAS DO CICLO • 1- DESNATURAÇÃO: É muito importante para que a fita do DNA molde alvo se separem; Inicialmente o termociclador irá elevar a temperatura da mistura de 92 a 96 ºC o que irá promover a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples através da quebra das pontes de hidrogênio. 5’ 3’ 3’ 5’ 92C 5’ 3’ + 3’ 5’
- 14. ETAPAS DO CICLO • 2-Anelamento: Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam as duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase. 5’ 3’ Forward primer Reverse primer 3’ 5’
- 15. ETAPAS DO CICLO • 3-Extensão:Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da Taq polimerase) para a duplicação da fita. A Taq polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla.
- 16. PRODUTO FINAL DAPCR • DNA primeira copia • PCR
- 21. DETECÇÃO DOS PRODUTOSDE PCR Finalizada a PCR o próximo passo é detectar a presença de produtos amplificados; Em geral isso é realizado pela eletroforese em gel de agarose ou acrilamida.
- 22. PCR PONTOS IMPORTANTES PARA O BOM FUNCIONAMENTO DA PCR
- 23. PONTOS IMPORTANTES: •Concentrações de “primers” entre 0,1 e 0,5ϻM são geralmente ótimas. Concentrações mais altas podem resultar em acúmulo de produtos não específicos, reduzindo a concentração do produto desejado. Concentrações mais baixas podem ser esgotadas previamente ao final da reação, resultando em baixa concentração do produto desejado; • A temperatura de anelamento depende do comprimento e composição dos primers. Uma temperatura de anelamento baixa demais resulta em anelamento não-específico e, portanto, amplificação não-espeífica. Enquanto, que uma temperatura muito alta resulta numa reduzida concentração do produto.
- 24. PONTOS IMPORTANTES: •Para o sucesso da PCR, a seqüência gênica a ser amplificada deve estar intacta. Uma qualidade pobre de DNA, irá frequentemente conter iniciadores que deveriam ser desenhados para amplificar regiões curtas dentro do molde; • A proporção iniciador/molde influencia significantemente a PCR e deveria ser otimizada empiricamente. Baixa concentração de DNA é necessária para uma PCR ótima; • Tipicamente, menos de 0,2ϻg de DNA pode ser suficientemente amplificado em 30 ciclos. A pureza do molde também influencia no resultado da reação.
- 25. PCR APARECIMENTO DE BANDAS INESPECÍFICAS NA PCR O QUE FAZER?
- 26. SUGESTÃO • Reduzaa quantidade de DNA; • Diminuir o tempo de anelamento da reação; • Aumente a temperatura de anelamento; • Reduza a concentração da enzima; • Reduza a concentração de Mg²⁺; • Aumento do tempo de desnaturação; • Aumento da temperatura de desnaturação; • Reduza o tempo de extensão; • Reveja os desenhos dos primers.
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- 28. PCR A REAÇÃOESTAVA FUNCIONANDO ANTES, MAS AGORA EU NÃO OBTENHO NENHUM PRODUTO. O QUE FAZER?
- 29. SUGESTÃO • Tenhacerteza que todos os componentes estão na reação (tampão, DNA, primers…); • Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos); • Utilize um estoque novo de primers; • Diminua sua temperatura de anelamento,se não obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.
- 30. VANTAGENS DA TÉCNICA • Capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA; • Rápida; • De baixo custo;
- 31. LIMITAÇÕES • Necessidadede conhecer a sequência de DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers específicos; • Facilidade de contaminação da amostra; • Extensão limitada da sequência a se amplificar; • Limitada extensão da sequência; • Incorporação errônea de bases durante a replicação.
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