O documento descreve a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), incluindo seus componentes, aplicações e variações. A PCR permite copiar DNA in vitro e foi desenvolvida em 1984, revolucionando a biologia molecular. Sua importância é comparada à descoberta da estrutura do DNA.

1. Centro Universitário - UNIBRASIL
PCR
Reação em Cadeia de
Polimerase
Professora: Lyia
Alunas: Aldiny Paula
Kamelyn Casagrande
4BMAD

2. PCR – consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”,
usando os elementos básicos do processo de
replicação natural do DNA.
PCR alcançou objetivos bem mais amplos que os
propostos inicialmente. PCR é comparada em
importância à definição da estrutura do DNA.

3. 1984 - PCR foi apresentada pela primeira em
um encontro científico
Publicação:
Mullis and Faloona, 1987
Saiki at al. 1988
1976: Thomas D. Brock descobriu a DNA polimerase
termoestável de Thermus aquaticus.
1988: Esta DNA polimerase foi usada por Saiki para
fazer PCR.

4. PCR requer 7 componentes essenciais:
- DNA polimerase termoestável
- Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese
de DNA
- Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
- Cátion divalente: toda DNA pol. requer cátion
divalente, usualmente Mg2+
- Tampão para manter o pH
-Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl)
- Template de DNA

6. Considerações
-Validade dos reagentes
-Número de congelamentos e
descongelamentos
-Contaminação (cabelos, pele...)
-Pureza (1,8 valor de referência,
espectrofotômetro)
-Quantidade de material genético
–Pouco: pouca amplificação
–Muito: pouca amplificação
Abs 260
P= ________
Abs 280

7. PCR é um processo iterativo, consistindo de
três elementos:
1- Desnaturação da template por aquecimento
2- Pareamento dos iniciadores à sequência alvo fita
única
3- Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase
termoestável

8. Cada uma das novas fitas de DNA estendidas a partir
dos “primers” serve como template para síntese de
uma nova fita. Os “primers” presentes na reação
fazem o pareamento com as novas fitas, na região de
complementariedade antiparalela entre “primer”-
“template”. Isso garante a aumento exponencial do
número de novas fitas.
Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR
têm a sequência de um dos primers na extremidade 5’
e a sequência complementar ao outro primer na
extremidade 3’

11. Fases da PCR:
1ª Fase: Aquecimento a mais
de 90ºC para a separação da
dupla fita
Separa tanto a Fita de DNA original quanto os
produtos de amplificação
2ª Fase: Anelamento dos primers
Hibridização
Temperatura varia entre 40 a 70ºC conforme o par de
primers
Determina a especificidade da ligação

12. 3ª Fase: Extensão dos primers - duplicação do DNA
Temperatura ótima em torno de 72ºC
Ao final da reação, a quantidade de DNA amplificado
em relação ao DNA inicial é igual a 2n, sendo que n=
número de ciclos da PCR
Exemplo: PCR de 29 ciclos: 229= 536.870.912 cópias
para cada fita original

13. 1989 - DNA Thermal Cycler, primeiro termociclador
automático

15. Efeito Plateau: desvio da quantidade teórica
>>Perda da atividade da Polimerase
>>Acúmulo de inibidores
>>Limitação dos componentes
>>Competição entre produtos
>>Pareamento Produto x Molde
>>Competição com anelamento do primer

16. Tipos de PCR e Variações da técnica

17. PCR que ocorre dentro de uma célula em lâmina.
Pode ser realizada em células ou tecidos fixados.

18. Variação da PCR
Convencional, na qual são
utilizados 2 pares de
primers (ao invés de um
par), para amplificar um
mesmo fragmento.
2 Pares para amplificar
um mesmo fragmento

19. PCR com 2 ou mais conjuntos de primers para
amplificar diferentes fragmentos de uma mesma
amostra.
Amplificar diferentes
fragmentos de uma
mesma amostra

20. Real Time – PCR
-Detecção, amplificação e quantificação numa única
etapa (agilidade na obtenção de resultados)
-É uma ótima técnica quantitativa e muito utilizada
atualmente
-Utiliza Mix comerciais como reagente
Metodologia da PCR
+
Detecção de sinais
fluorescentes

22. PCR: Aplicabilidade
- diagnóstico médico (Polimorfismos)
- mapeamento genético
- detecção de doenças hereditárias
- clonagem de genes
- testes de paternidade
-criação de organismos transgênicos
-Genética forense

23. Real Time – PCR:
-Todas as aplicações da PCR tradicional
-Quantificação de Carga Viral
-Quantificação de Expressão gênica
-Testes de Eficiência terapêutica
-Detecção de Agentes Infecciosos
-Caracterização de Agentes (Genotipagem)

24. Doença de Alzheimer
-Genes da proteína β- amilóide
(PPA,cromossomo 21) e
-Da proteína apolipoproteína E
(APOE, cromossomo 19) >> PSEN1, PSEN2, TNF-a,
o PSEN1 e o CYP46

25. Referencias utilizadas:
BOTELHO, Ingrid Thaís Beltrame .Reação em cadeia da Polimerase.
UFSC. Disponível em:<http://proto.ufsc.br/files/2012/03/PCR.pdf> .Acesso
em:26/10/2015
VIEIRA, Daniel Perez. Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de
Reações. Disponível em:< http://etallcorp.xpg.uol.com.br/aula3.pdf>.
Acesso em:27/10/2015

26. Obrigada!!