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Pcr
- 1. Reação de Polimerização em Cadeia (PCR)
- 2. DNA É umácido nucléico constituído por 2 nucleotídeos complementares construíndo uma cadeia. Possui 4 bases: 2 Purinas: Adenia (A) Guanina (G) 2 Piramidinas: Citosina (C) Tiamina (T) Exemplo dos padrões de ligação: Cadeia Primária CCGAATGGGATGC GGCTTACCCTACG Cadeia Complementar
- 3. DNA Existem 2 métodospara amplificar ou fazer cópias de DNA: Clonagem - demora um longo tempo para os clones atingirem a maturidade PCR - trabalha em até uma única molécula rapidamente 3’ 5’ 5’ 3’ www.ambion.com
- 4.
- 5. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia (PCR) A tecnologia PCR permite que os cientistas peguem a amostra de um material genético, até mesmo de uma célula, copiem a sequência deste material genético várias vezes e gere uma amostra suficiente para detectar a presença ou ausência de um vírus específico, de uma bactéria ou qualquer sequência de um material genético
- 6. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia -PCR amplifica uma região específica da cadeia de DNA -É uma técnica “in vitro” que produz grande quantidade de um DNA específico -Geralmente uma pequena quantidade de DNA está disponível, por exemplo: gota de sangue, resquícios de semen, fio de cabelo...
- 7. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia HISTÓRICO Kary Mullis (1985) Patente (1989) Prêmio Nobel de Química (1993) http://www.google.com/imgres
- 8. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia APLICAÇÕES: Microbiologia clínica Vírus (HIV, HCV, HBV...) Bactéria (Salmonela, Micobactéria...) Fungos (Candida...) Oncologia Clínica Monitorar doença residual (micro-metastases) Testes genéticos para identificar polimorfismos Monitorar enxertos após transplantes de orgãos Monitoramento após trasplante de medula Sequenciamento de genes
- 9. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia APLICAÇÕES: Diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas Detecção de agentes patogênicos e mutações Testes de paternidade Determinação do sexo apartir do sangue materno Medicina forense Criação de organismos transgênicos Clonagem
- 10. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia “Amplificação" ou multiplicação exponencial dos segmentos de DNA, facilitando sua análise: -PCR Tradicional: Géis de agarose ou poliacrilamida -PCR Real Time: Sistemas automatizados (sinais gráficos)
- 11. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia O QUE É NECESSÁRIO?
- 12. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia O QUE É NECESSÁRIO? Pequenas quantidades do DNA alvo Primers (oligonucleotídeos iniciadores) Taq polimerase dNTPs (desosirribinucleotídoes constituintes do DNA) Mg2+ Taq/ DNA Polimerase Co-fator Mg2+ dCTP dGTP Primer dTTP Iniciador dATP oligonucleotídeo www.gene-quantification.info
- 13. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia PROCEDIMENTOS 1º: Extração do material genético DNA ou RNA, RT-PCR 2º: Adição do pré mix (solução tampão) 3º: Termociclador (aquecimento e resfriamento)
- 14. Etapas do Procedimento Desnaturação •Primeiraetapa do processo •As cadeias de DNA são separadas pelo aquecimento a 95 graus •As ligações de hidrogênio se rompem •Duração 1 minuto
- 15. Etapas do Procedimento Anelamento •Segundaetapa do processo •Ocorre a formação de pontes de hidrogênio •O anelamento da sequência alvo e o primer ocorre após resfriamento a 55 graus •Duração 45 segundos
- 16. Etapas do Procedimento Alongamento •TaqPolimerase se liga ao DNA template e começa a adicionar nucleotídeos •Reação ocorre a 72 graus •Duração 1 a 2 minutos
- 17. Taq DNA Polymerase •Enzimacapaz de suportar altas temperaturas •Taq- Thermus aquaticus, bactéria descoberta nas fontes termais da Floresta Nacional Yellow Stone www.wikipedia.com/taqpolymerase
- 18. Temperatur Tempo Ciclo Finalidade a (s) 1ª Desnaturação (separação do 94-96ºC 20-60 etapa DNA) 94ºC/30s Anelamento dos primers com 2ª 50 a 60ºC 20-90 DNA etapa 50ºC/15 a 30s - ºGC Extensão dos iniciadores
- 19. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia PROCEDIMENTOS http://ldmvet.com.br/fotos.html#
- 20. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia COMO ESCOLHER O PRIMER?
- 21. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia PRIMER/ INICIADOR SELEÇÃO DE PRIMERS •Sintetizados quimicamente •15 a 25 bases •Define limites de alvo a amplificar •Serve como ponto de início para a replicação •Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duas direções (para frente e para trás)
- 22. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia PRIMER/ INICIADOR SELEÇÃO DE PRIMERS •Banco de Dados International Nucleotide Sequence Database (www.insdc.org) GenBank (NCBI, NIH) European Molecular Biology Laborstory (EMBL) DNA DataBank of Japan (DDBJ) www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
- 23. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia PROBLEMAS COM O PRIMER •Deve atingir sequência de interesse •Primers que coincidem com multiplas sequências podem gerar multiplos produtos •Podem se auto-complementar e fazer ligação com outro primer (hairpin)
- 24. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia CARACTERÍSTICAS: ESPECIFICIDADE: Amplifica sequência-alvo na presença de DNA genômico Escolha dos primers SENSIBILIDADE: Detecta até apenas 1 sequência de molde FLEXIBILIDADE: Muitas variações da técnica básica de PCR
- 25. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia VARIAÇÕES DA TÉCNICA BASICA DE PCR • RAPD • PCR-RFLP • Multiplex PCR • Nested-PCR • Hot start • Inverse PCR • Colony PCR • Allele specific PCR • PCR em tempo real
- 26. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia Amplificação do DNA mediante o PCR 25 a 40 ciclos para cada reação Taxa de replicação: 2ciclos
- 27. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html
- 28. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia Como analisar os resultados da PCR Eletroforese Separar os fragmentos por tamanho, pois a reação gera fragmentos com a mesma extensão /www.roche-applied-science.com/techresources/index.jsp
- 29. Reação de Polimerizaçãoem Cadeia Como analisar os resultados da PCR •Bandas geradas pela amplificação de 5 diferentes receptores de membrana de macrófagos de camundongo (Lanes 2 a 6)
- 30. PCR TRADICIONAL (GÉIS DE AGAROSE) Desvantagens Pobre precisão Baixa sensibilidade Baixa resolução Não automatizado Discriminação baseado no tamanho do fragmento Resultados não são expressos em números Colorações não são muito quantitativas Pós-processamento do produto da PCR Contaminação
- 31. REAL TIME PCR PCR EM TEMPO REAL SISTEMA TEMPO REAL •Sistema óptico •Termociclador •Hardware •Software •Fluoróforos http://ldmvet.com.br/fotos.html#
- 32. REAL TIME PCR PCR EM TEMPO REAL Vantagens Detecta e quantifica, em tempo real, ácidos nucléicos enquanto são amplificados Ciclos mais rápidos MAIS ESPECÍFICO, SENSÍVEL e REPRODUZÍVEL Não é muito mais caro que a PCR convencional - Exceção: preço do equipamento Desvantagens Requer alta habilidade técnica e suporte Alto custo do equipamento
- 33. REAL TIME PCR PCR EM TEMPO REAL •A química utilizada na PCR em Tempo Real permite a detecção de um determinado fragmento durante a sua amplificação, já nas primeiras etapas da reação TaqMan® SYBR® Green http://ldmvet.com.br/fotos.html#
- 34. REAL TIME PCR PCR EM TEMPO REAL http://ldmvet.com.br/fotos.html#
- 35. REAL TIME PCR PCR CONVENCIONAL(GÉIS DE AGAROSE) x PCR EM TEMPO REAL www.gene-quantification.info
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- 39. REFERÊNCIAS •Alberts et, MolecularBiology of the Cells, Garland Science, 4th ed, 2002 •Lodish, Molecular Cell Biology, Freeman & Co., 4th ed., 2000 •Cooper et al, The Cell- A molecular Approach, Sinauer Publishers, 2nd ed., 2000 •Dewar R, Goldstein D, Maldarelli F. Diagnosis of human immunodeficiency virus infection. In: Mandell GL, Bennett GE, Dolin R, eds. Principles and Practice of Infectious Diseases. 7th ed. Philadelphia, Pa: Elsevier Churchill Livingstone; 2009:chap 119. •Sax PE, Walker BD. Immunopathogenesis of human immunodeficiency infection. In: Goldman L, Ausiello D, eds. Cecil Medicine. 23rd ed. Philadelphia, PA: Saunders Elsevier; 2007:chap 408. •Guatelli JC, Gingeras TR, Richman DD (1 April 1989). "Nucleic acid amplification in vitro: detection of sequences with low copy numbers and application . Clin. Microbiol. Rev. 2 (2): 217–26. •www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html PMC 358112. PMID 2650862. •http://ldmvet.com.br/fotos.html# •http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html •www.labimuno.org.br •www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html •www.wikipedia.com/taqpolymerase
Notas do Editor
- #3 O dna eh uma dupla fita constituida por nucleotideos A+ T – duas pontes de hidrogênio G+C – tres pontes de hidrogenio
- #4 cadeia pr
- #8 O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da década de 1980. Em 1985 ele introduziu o PCR para a comunidae científica e a Cetus Corporation, empresa na qual ele trabalaha recompensou-o com $10.000 pela invenção. Em 1989, a Cetus vendeu a patente para a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation por $300 milhões Posteriormente, em 1993, foi atribuído o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho.
- #9 Aplicações O PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações do PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting . O PCR também é rotineiramente utilizado em procedimentos científicos de Biologia Molecular como amplificação para gerar mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em plasmídeo, por exemplo) como Também pode ser utilizado para identificação de patógenos que estão presentes em amostras como por a exemplo identificação de agentes como Cândida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vírus do papiloma humano e seus genótipos, HBV Vírus da Hepatite B. etc O PCR também é utilizado na paleontologia para o sequenciamento genico de animais pré-históricos.
- #10 PCR-based tests are able to detect the presence of pathogenic agents earlier than serologically-based methods, as patients can take weeks to develop antibodies against an infectious agent. Earlier detection of infection can mean earlier treatment and an earlier return to good health
- #11 método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro , uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense entre muitas outras para além da Investigação em Biologia. É uma técnica utilizada em Biologia Molecular que permite a "amplificação" ou multiplicação exponencial de segmentos de DNA, facilitando sua análise, posteriormente realizada através de géis de agarose ou poliacrilamida ou de sistemas automatizados que geram sinais gráficos. Os segmentos que estão sendo estudados são flanqueados através de outros segmentos menores que iniciam a reação e são chamados de iniciadores ou "primers". -- ELETROFORESE O fenômeno denominado Eletroforese é definido como sendo a migração de espécies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual uma corrente elétrica é aplicada. Esta técnica de separação foi desenvolvida pelo químico Arne Tiselius para o estudo de proteínas em soro e por este trabalho ele ganhou o prêmio Nobel em 1948. Este método, denominado solução livre, era bastante limitado devido à instabilidade do aparelho, e mais significativamente, pelos efeitos de difusão e aquecimento gerados pelo campo elétrico, os quais comprometiam a resolução (a separação) dos compostos. Estes efeitos foram minimizados com a introdução de suporte (gel ou papel) que ajudou a conter o movimento livre dos analitos, de forma que o efeito da difusão fosse diminuído. Entretanto este sistema oferecia um baixo nível de automação, tempos de análise longos e após a separação a detecção era feita visualmente
- #12 Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA). Primer: segmentos menores que iniciam a reação e rodeiam os segmentos que estão sendo estudados Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg 2+ . Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem em: Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar) Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC
- #13 Concentração de Mg 2+ afeta: anelamento dos primers temperatura de desnaturação do DNA molde e dos produtos amplificados Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA). Primer: segmentos menores que iniciam a reação e rodeiam os segmentos que estão sendo estudados Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg 2+ . Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem em: Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar) Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA).
- #14 Procedimentos A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo . Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações. Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado). Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar) Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96°C por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60°C dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72°C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2 ciclos O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente. 1. A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleotídeos de DNA e os primers complementares a seqüência de DNA são colocados em um tubo de ensaio. 2. Coloca-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR (maquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e resfrimento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa. 3. Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla fita) o DNA. 4. Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam ao início das duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase. 5. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase) para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementariendade, formando assim uma nova fita dupla. Ocorrendo a fragmentação das moléculas de DNA, com o uso das enzimas de restrição, e o seu reconhecimento pela técnica de eletroforese em gel, o próximo passo é multiplicar (clonar) o fragmento obtido e submetê-los à tecnologia do DNA recombinante. A técnica de multiplicação da fita de DNA é chamada de PCR ( reação em cadeia da polimerase ).
- #15 http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/enzimasderestricao.php http://www.saberweb.com.br/genetica/pcr.htm PCR
- #16 A partir da década de 1970, ficou mais fácil analisar a molécula de DNA com o isolamento da enzimas de restrição. Estas enzimas são endonucleases , ou seja, no interior (daí o prefixo endo - dentro) das moléculas de DNA, cortando-as em locais bem definidos. Além de evidenciar a existência de um novo sistema de defesa bacteriana e da complexa interação entre bactéria e vírus parasitas, a descoberta das enzimas de restrição permitiu grandes avanços na Genética Molecular. Por isso, os três pesquisadores responsáveis pela elucidação do mecanismo de ação das endonucleases de restrição, o suíço Werner Arber (n. 1931) e os norte-americanos Daniel Nathans (1928-1999) e Hamilton Smith (n.1931), receberam o Prêmio Nobel em Medicina ou Fisiologia em 1978. Moléculas idênticas de DNA tratadas com determinada endonuclease de restrição são cortadas nos mesmos pontos, originando fragmento de tamanho idênticos. Por exemplo, no primeiro estudo com endonuclease de restrição, realizado em 1971, o virologista Daniel Nathans e uma de suas estudantes, Kathleen Danna, trataram DNA do vírus SV40 com a enzima Hind II e obtiveram 11 tipos de fragmentos, que diferiam em tamanho. Como o DNA desse vírus é uma molécula circular, conclui-se que ela foi cortada em 11 locais; o tamanho de cada fragmento correspondia à distância entre dois sítios de corte adjacentes. Uma endonuclease de restrição é como uma ferramenta que permite cortar moléculas de DNA de forma controlada e reprodutível. Diversos pesquisadores passaram a utilizar a nova técnica para mapear o genoma de outros vírus, depois de bactérias e de outros organismos, lançando as bases para a Engenharia Genética e, em seguida para o Projeto Genoma Humano. Tipos de enzimas de restrição Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição. [2] [editar] Utilização no corte de DNA genômico A maioria dos cortes de DNA genômico é feita usando enzimas de restrição bacterianas. Estas enzimas cortam em seqüências-alvo específicas para DNA, chamados sítios de restrição , e esta propriedade é uma das características principais que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA. Puramente por acaso, qualquer molécula de DNA, seja ela derivada de um vírus, mosca ou humano, contém alvos para enzimas de restrição. A enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelas localizações dos sítios de restrição. Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição são as "pontas adesivas". Vejamos um exemplo. A enzima de restrição EcoRI (de Coli) reconhece a seguinte seqüência de seis pares de nucleotídeos no DNA de qualquer organismo: Tipos de enzimas de restrição Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição. [2] [editar] Utilização no corte de DNA genômico A maioria dos cortes de DNA genômico é feita usando enzimas de restrição bacterianas. Estas enzimas cortam em seqüências-alvo específicas para DNA, chamados sítios de restrição , e esta propriedade é uma das características principais que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA. Puramente por acaso, qualquer molécula de DNA, seja ela derivada de um vírus, mosca ou humano, contém alvos para enzimas de restrição. A enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelas localizações dos sítios de restrição. Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição são as "pontas adesivas". Vejamos um exemplo. A enzima de restrição EcoRI (de Coli) reconhece a seguinte seqüência de seis pares de nucleotídeos no DNA de qualquer organismo:
- #17 As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição como também são conhecidas, são enzimas que cortam a molécula de DNA através do reconhecimento de seqüências nucleotídicas específicas. São enzimas bacterianas Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases Chamadas enzimas (ou endonucleases) de restrição, elas cortam a molécula em regiões específicas e dividem o DNA em segmentos. As bactérias possuem mecanismos que impedem a ação das suas enzimas de restrição contra o seu próprio DNA. Tipos de enzimas de restrição Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição. [2]
- #18 São enzimas produzidas normalmente por bactérias e que possuem a propriedade de defende-las de vírus invasores. Estas enzimas funcionam nas células bacterianas como parte de um mecanismo de protecção ao ataque de bacteriófagos chamado sistema de restrição modificação. [1] Uma molécula de DNA viral que continha sítios para uma endonuclease bacteriana, ao ser injetada na bactéria, é prontamente cortada nesses pontos e deixa de funcionar. O DNA da própria célula bacteriana é protegido por metilação . Hoje são conhecidas centenas dessas enzimas, que são purificadas e comercializadas por diversos laboratórios no mundo. O local do “corte”, o local de uma enzima, é conhecido como sítio alvo. Você pode perguntar porque essa enzima não atua no DNA da própria bactéria? Isso não ocorre devido à existência de outras enzimas protetoras, que impedem a ação das enzimas de restrição no material genético da bactéria Elas são altamente específicas: cada tipo de enzima reconhece e corta apenas uma determinada seqüência de nucleotídeo, em geral constituída por 4 ou 6 pares de bases nitrogenadas. Além de evidenciar a existência de um novo sistema de defesa bacteriana e da complexa interação entre bactéria e vírus parasitas, a descoberta das enzimas de restrição permitiu grandes avanços na Genética Molecular. Por isso, os três pesquisadores responsáveis pela elucidação do mecanismo de ação das endonucleases de restrição, o suíço Werner Arber (n. 1931) e os norte-americanos Daniel Nathans (1928-1999) e Hamilton Smith (n.1931), receberam o Prêmio Nobel em Medicina ou Fisiologia em 1978. Moléculas idênticas de DNA tratadas com determinada endonuclease de restrição são cortadas nos mesmos pontos, originando fragmento de tamanho idênticos. Por exemplo, no primeiro estudo com endonuclease de restrição, realizado em 1971, o virologista Daniel Nathans e uma de suas estudantes, Kathleen Danna, trataram DNA do vírus SV40 com a enzima Hind II e obtiveram 11 tipos de fragmentos, que diferiam em tamanho. Como o DNA desse vírus é uma molécula circular, conclui-se que ela foi cortada em 11 locais; o tamanho de cada fragmento correspondia à distância entre dois sítios de corte adjacentes. Uma endonuclease de restrição é como uma ferramenta que permite cortar moléculas de DNA de forma controlada e reprodutível. Diversos pesquisadores passaram a utilizar a nova técnica para mapear o genoma de outros vírus, depois de bactérias e de outros organismos, lançando as bases para a Engenharia Genética e, em seguida para o Projeto Genoma Humano. Tipos de enzimas de restrição Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição. [2] [editar] Utilização no corte de DNA genômico A maioria dos cortes de DNA genômico é feita usando enzimas de restrição bacterianas. Estas enzimas cortam em seqüências-alvo específicas para DNA, chamados sítios de restrição , e esta propriedade é uma das características principais que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA. Puramente por acaso, qualquer molécula de DNA, seja ela derivada de um vírus, mosca ou humano, contém alvos para enzimas de restrição. A enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelas localizações dos sítios de restrição. Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição são as "pontas adesivas". Vejamos um exemplo. A enzima de restrição EcoRI (de Coli) reconhece a seguinte seqüência de seis pares de nucleotídeos no DNA de qualquer organismo: Tipos de enzimas de restrição Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição. [2] [editar] Utilização no corte de DNA genômico A maioria dos cortes de DNA genômico é feita usando enzimas de restrição bacterianas. Estas enzimas cortam em seqüências-alvo específicas para DNA, chamados sítios de restrição , e esta propriedade é uma das características principais que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA. Puramente por acaso, qualquer molécula de DNA, seja ela derivada de um vírus, mosca ou humano, contém alvos para enzimas de restrição. A enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelas localizações dos sítios de restrição. Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição são as "pontas adesivas". Vejamos um exemplo. A enzima de restrição EcoRI (de Coli) reconhece a seguinte seqüência de seis pares de nucleotídeos no DNA de qualquer organismo:
- #19 Elas são, em geral constituída por 4 ou 6 pares de bases nitrogenadas. altamente específicas: cada tipo de enzima reconhece e corta apenas uma determinada seqüência de nucleotídeo Essas substâncias “picotam” a molécula de DNA sempre em determinados pontos, levando a produção de fragmentos contendo pontas adesivas, que podem se ligar a outras pontas de moléculas de DNA que tenham sido cortadas com a mesma enzima . Moléculas idênticas de DNA tratadas com determinada endonuclease de restrição são cortadas nos mesmos pontos, originando fragmento de tamanho idênticos. Por exemplo, no primeiro estudo com endonuclease de restrição, realizado em 1971, o virologista Daniel Nathans e uma de suas estudantes, Kathleen Danna, trataram DNA do vírus SV40 com a enzima Hind II e obtiveram 11 tipos de fragmentos, que diferiam em tamanho. Como o DNA desse vírus é uma molécula circular, conclui-se que ela foi cortada em 11 locais; o tamanho de cada fragmento correspondia à distância entre dois sítios de corte adjacentes. Uma endonuclease de restrição é como uma ferramenta que permite cortar moléculas de DNA de forma controlada e reprodutível. Diversos pesquisadores passaram a utilizar a nova técnica para mapear o genoma de outros vírus, depois de bactérias e de outros organismos, lançando as bases para a Engenharia Genética e, em seguida para o Projeto Genoma Humano. Tipos de enzimas de restrição Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição. [2] Utilização no corte de DNA genômico A maioria dos cortes de DNA genômico é feita usando enzimas de restrição bacterianas. Estas enzimas cortam em seqüências-alvo específicas para DNA, chamados sítios de restrição , e esta propriedade é uma das características principais que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA. Puramente por acaso, qualquer molécula de DNA, seja ela derivada de um vírus, mosca ou humano, contém alvos para enzimas de restrição. A enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelas localizações dos sítios de restrição. Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição são as "pontas adesivas". Vejamos um exemplo. A enzima de restrição EcoRI (de Coli) reconhece a seguinte seqüência de seis pares de nucleotídeos no DNA de qualquer organismo: Em Engenharia Genética, a obtenção dos fragmentos de DNA serve para criar, in vitro (em tubo de ensaio ou no laboratório), novas moléculas, recortando e colando vários pedaços de informações
- #20 As enzimas de restrição reconhecem e atuam sobre seqüências específicas de DNA , catalisando a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos consecutivos ligados a determinadas bases. Os nucleotídeos entre os quais a enzima corta, ou seja, entre os quais promove a hidrólise, encontram-se no interior dessas mesmas sequências específicas de reconhecimento (ver imagem). Cada molécula de DNA pode ser composta de várias repetições da seqüência GAATTC ao longo de toda sua extensão. Portanto ao contato com a ezima EcoRI a fita de DNA pode ser clivada "cortada" em diversos lugares, gerando vários pedaços, de tamanhos diferentes.
- #21 Uma das primeiras enzimas de restrição a ser isolada foi a EcoRI , produzida pela bactéria Escherichia coli . Essa enzima reconhece apenas a seqüência GAATTC e atua sempre entre o G e o primeiro A. Desde de sua identificação, em 1970, mais de 100 diferentes tipos de enzimas de restrição bacterianas foram identificados. A nomenclatura compõe-se das iniciais do nome da espécie e, às vezes, da sigla da linhagem da bactéria que a produz.Por exemplo a enzima EcoRI, veja no box.
- #23 O primer serve como ancora para a taq polimerese e ação da polimerase depende da hidroxila que está no primer se não não haveria polimerisacao dos nucleotideos. Os nucleotideos são ligados uns aos outros. Fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é se ligam por complementaridade ao início da seqüência de DNA que se quer multiplicar. Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de primers diferentes (veja a figura)
- #24 Dna polimerase pega os nucleotideos e eh incorporado à fita • Atividade se mantém após exposição ao calor
- #25 DNA polimerase termo estável suporta elevadas encontrada em fontes termais (80 graus)
- #27 http://ldmvet.com.br/fotos.html#
- #31 são oliginucleotideos, que é um fragmento curto da cadeia de DNA geralmente 20 beses. Utilizados para amplificar as sequencias de DNA
- #32 método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro , uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense entre muitas outras para além da Investigação em Biologia. É uma técnica utilizada em Biologia Molecular que permite a "amplificação" ou multiplicação exponencial de segmentos de DNA, facilitando sua análise, posteriormente realizada através de géis de agarose ou poliacrilamida ou de sistemas automatizados que geram sinais gráficos. Os segmentos que estão sendo estudados são flanqueados através de outros segmentos menores que iniciam a reação e são chamados de iniciadores ou "primers". -- ELETROFORESE O fenômeno denominado Eletroforese é definido como sendo a migração de espécies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual uma corrente elétrica é aplicada. Esta técnica de separação foi desenvolvida pelo químico Arne Tiselius para o estudo de proteínas em soro e por este trabalho ele ganhou o prêmio Nobel em 1948. Este método, denominado solução livre, era bastante limitado devido à instabilidade do aparelho, e mais significativamente, pelos efeitos de difusão e aquecimento gerados pelo campo elétrico, os quais comprometiam a resolução (a separação) dos compostos. Estes efeitos foram minimizados com a introdução de suporte (gel ou papel) que ajudou a conter o movimento livre dos analitos, de forma que o efeito da difusão fosse diminuído. Entretanto este sistema oferecia um baixo nível de automação, tempos de análise longos e após a separação a detecção era feita visualmente
- #33 1. primer q amplifica mtas coisas pai mae e filho - exame de dna 2. pcr e uma digestao: faz pcr depois digestao por enxima de restricao...gera padrao de bandas e sabe qm eh filho de qm fragmento ou amplicon multiplex qdo uso dois primer entao terá duas bandas rna so tem informacao p codificar ptn...vai verificar se a celula produz akela proteina
- #34 http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar) Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC Primeira Etapa : As duplas fitas de DNA que estão unidas através de fracas ligações chamadas pontes de hidrogênio, são separadas por um aumento da temperatura. Segunda Etapa: Os primers se anelizam à regiões homólogas do DNA da fita mãe. Se não houver regiões homólogas, eles não se anelizarão e não ocorrerá a formação de uma nova fita. Portanto, não haverá amplificação de DNA, não ocorrendo o aparecimento da banda correspondente em gel de agarose e poliacrilamida ou do sinal gráfico no eletroferograma em sistemas automatizados. Terceira Etapa: Uma enzima termoestável chamada Taq DNA Polymerase age fixando os nucleotídeos na fita complementar que vai ser formada a partir da fita molde. Desta maneira, no primeiro ciclo irão se formar quatro fitas a partir das duas primeiras; no segundo ciclo irão se formar oito fitas, e assim por diante. Ao final de trinta e seis ciclos, teremos uma quantidade de fitas de DNA da ordem de 2 ou 137.438.973.472 de fitas a partir das duas primeiras. --------------- O processo envolvendo estes três passos, pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente (figura 2). Em teoria, se for possível levar a cabo 25 ciclos de amplificação seguidos, a concentração de DNA aumentaria 2 25 vezes embora, na prática, devido a alguma ineficiência no processo de amplificação, esse aumento fique por um milhão de vezes. Como na técnica de PCR se encontram envolvidos vários ciclos de amplificação, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada, os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento/resfriamento. Para tal ser concretizável, as DNA polimerases utilizadas deverão ser termoestáveis, tendo tal sido conseguido com o isolamento da DNA polimerase da estirpe termofílica Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) que actua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da especificidade da reacção. De referir ainda que o produto de PCR pode ser visualizado após electroforese em gel de agarose e o seu tamanho ser estimado por comparação com padrões lineares de DNA.
- #35 Procedimentos A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo . Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações. Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado). Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96°C por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60°C dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72°C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2 ciclos O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.
- #36 1. primer q amplifica mtas coisas pai mae e filho - exame de dna 2. pcr e uma digestao: faz pcr depois digestao por enxima de restricao...gera padrao de bandas e sabe qm eh filho de qm fragmento ou amplicon multiplex qdo uso dois primer entao terá duas bandas rna so tem informacao p codificar ptn...vai verificar se a celula produz akela proteina
- #37 A lane L indica o padrão de peso molecular e a 1 indica o a banda controle, resultado da amplificação do gene da β -actina. Como a banda controle está nítida, o resultados das reações para a detecção dos receptores foram considerados positivos, pois além das bandas estarem presentes no gel, o controle mostra-se positivo também, confirmando os resultados. Este gel mostra produtos da amplificação dos mesmos receptores da figura acima. O controle também está presente, o que indica a fidelidade da reação. Neste caso, a amostra 2 foi considerada negativa para a PCR.
- #38 * Pobre precisão * Baixa sensitividade * Curta extensão dinâmica (< 2 logs) * Baixa resolução Não automatizado Resultados não são expressos em números * Colorações não são muito quantitativas * Pós-processamento do produto da PCR * Contaminação (brometo) Discriminação baseada apenas no tamanho do fragmento
- #40 http://www.publicacoesweinmann.com.br/2009/04/pcr-quantitativo-em-tempo-real.html http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio33/bio33.pdf O método determina a quantidade inicial de um produto (DNA/RNA) através do comportamento da cinética de amplificação das diferentes fases ao longo dos ciclos de uma PCR, ou seja, detecta e quantifica, em tempo real, ácidos nucléicos enquanto são amplificados, sem a necessidade de realizar purificação e análises adicionais.
- #41 Atualmente, o uso da PCR por tempo real (Real Time) incorpora a detecção de sinais enquanto ocorre a amplificação. Para isso, utilizam-se oligonucleotídeos e sondas específicas que emitem fluorescência a cada hibridização e a cada passo de amplificação. Por detectar regiões específicas, essa técnica permite uma rápida e precisa quantificação de organismos infecciosos ou seqüências transgênicas. Este novo conceito eliminou todas as fases de análise pós-PCR . O software associado ao método garante precisão a partir de limiares muito baixos de detecção. Taqman é uma sonda que se liga entre os primers, que quando a taq polimerase passa quebra a sonda e tira a uniao do reporter com o quencher... o reporter sempre transmite fluorescencia e o quencher absover, quando eles perdem esta uniao o reporter fica dissossiado na solucao emitindo a fluorescencia O Sybr Green, ele se liga onde tiver pontes de hidrogenio..., qualquer dupla fica ele ta emitindo fluorescencia por isso e inespecifica... por que ligacao primer DNA emite fluorescencia.. entao e necessario voce fazer uma curva de melting para analisar o resultado certo quando voce tem a temperatura de desnaturação as fitas de DNA se separam por causa do aumento da temperatura e as pontes de hidrogenio se rompem certo quando voce amplifica algo com o SYBR voce precisa depois aumentar a temperatura e ver qual temperatura todas as pontes de hidrogenio quebram... e o SYBR fica dissossiado... "se nao tem mais ponte nao tem mais fluorescencia" se tiver um pico unico significa que todo produto de PCR gerado é especifico por que em um temperatura so a fluorescencia saiu entendeu
- #42 A masa e a porosidade do gel vai influenciar na migracao do dna para o polo positivo Gel pouco concentrado eh muito poroso e as moleculas grandes correm mais facilemnte Qdo o gel eh mto concentrado ele eh pouco poroso porem as menores correm muito bem Dependendo do tamanho da banda o gel não pode ser mto nem pouco poroso
- #47 A masa e a porosidade do gel vai influenciar na migracao do dna para o polo positivo Gel pouco concentrado eh muito poroso e as moleculas grandes correm mais facilemnte Qdo o gel eh mto concentrado ele eh pouco poroso porem as menores correm muito bem Dependendo do tamanho da banda o gel não pode ser mto nem pouco poroso