1) A PCR permite amplificar seletivamente DNA em grande quantidade com poucos recursos. 2) A reação envolve primers, DNA template, enzimas e ciclos de aquecimento e arrefecimento para duplicar o DNA. 3) A PCR tem muitas aplicações como detecção de mutações, sequenciamento de DNA e testes de paternidade.

1. Polymerase Chain Reaction (PCR) Prof. Msc. Eduardo Honda

2. A invenção da PCR 1983 Kary Mullis 1985 1º paper 1993 Nobel da Química

3. PCR, a ferramenta do futuro Grande quantidade de DNA em pouco tempo. Baixo custo A amostra de DNA não necessita de estar altamente purificada. PCR pode amplificar uma única molécula de DNA / RNA. O produto do PCR pode ser digerido com enzimas de restrição, sequenciado ou clonado.

4. A reacção

5. O que envolve a reacção? DNA Template Tampão da reacção (Tris, iões amónio (e/ou iões de potássio), iões de magnésio soro de albumina de bovino) Nucleótidos (dNTPs) Primers DNA polymerase (pex: Taq, Pfu )

6. Quantos ciclos?

7. Fidelidade da reacção A Taq comete ERROS Qual a importância dos erros? Como superá-los?

8. Termo-Cicladores

9. Funcionou? Se não…o que fazer?

10. Optimização da reacção de PCR Temperatura Tempos Concentração de Mg 2+ na reacção. Quantidade de template e de polymerase

11. DNA polimerases.. E. coli Taq Pfu – proofreading rTth DNA Polymerase

12. Concepção dos PCR Primers Comprimento: especificidade vs eficácia Temp de annealing Composição de bases Extremidade 3’ Regiões repetitivas do DNA Enzimas de restrição Estrutura secundária Homologias Intra e Inter-primer

13. Primers a formar Hairpins e Dímeros Complementaridade intra-primer – dobra em hairpin : Dímero de primers (intra ou inter primer).

14. Aplicações do PCR Multiplex PCR Real Time PCR PCR na detecção de polimorfismos e mutações patológicas PCR e a amplificação indiscriminada de sequências de DNA PCR na amplificação de sequências de DNA desconhecidas PCR assimétrico PCR e clonagem de DNA genómico PCR e clonagem de cDNA PCR e DNA Fingerprinting: casos da Biologia Forense e da Filiação genética

15. Multiplex PCR

16. Real time PCR

17. PCR usado na detecção de polimorfismos e mutações patológicas

18. Para detectar polimorfismos de local de restrição O que são polimorfismos? Porque existem os polimorfismos? Como se detectam esses polimorfismos?

19. PCR específico para um alelo e detecção de mutações Como se consegue discriminar entre duas sequências alvo que difiram num único nucleotídeo? Um só nucleotídeo faz a diferença? Como se interpretam os resultados?

20. Qual a vantagem? PCR permite amplificação indiscriminada de sequências de DNA

21. Linker-primed PCR Como decorre? O que é o linker? Que primers são usados?

22. Qual a vantagem? PCR usado para amplificar uma regiões desconhecidas que flanqueiam uma região previamente caracterizada

23. PCR inverso Quando se utiliza? Como são os primers? Como decorre o processo?

24. Os produtos amplificados do PCR são usados na sequenciação de DNA

25. PCR assimétrico Com que fim se utiliza? Porquê assimétrico?

26. Clonagem de DNA genómico ↓ Clonagem de cDNA ↓

27. PCR e DNA Fingerprinting Exemplo: “locus” D1S80

28. PCR e DNA Fingerprinting Suas principais aplicações: Biologia forense (ex. confirmação do autor de um crime) Filiação genética (ex. testes de paternidade)

30. PCR e Filiação genética Pai Mãe

31. O futuro da PCR PCR ↔ material genético Fotocopiadora ↔ material escrito tornando a cópia fácil, barata, acessível

32. O futuro da PCR Com a técnica de PCR iremos desvendar o nosso passado genético, bem como abrir o caminho para um futuro geneticamente traçado.

33. Referências Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular Genetics ;BIOS Scientific Publishers Limited; 1996; USA James D. Watson, Michael Gilman, Jan Witkwoski, Mark Zoller: Recombinant DNA; second edition ; 1992; New York,Scientific American Books Geoffrey M Cooper: The Cell , a molecular approach; second edition Alkami quick guide tm for PCR Rui Pereira; Biologia forense; Nov 2004 A. Silva, A. Fonseca, C. Teixeira, E. Sousa; FCUP; Testes de paternidade Raymond Dalgleish; Department of Genetics; The Polymerase Chain Reaction (PCR)