A Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) é uma técnica que permite a amplificação de DNA in vitro, utilizando polimerase termoestável e seguindo três etapas: desnaturação, anelamento e extensão. Desenvolvida por Kary Mullis nos anos 1980, essa técnica envolve ciclos de temperatura que facilitam a separação e replicação das fitas de DNA, com o uso de primers específicos. A eficiência da PCR pode variar de 78% a 97% devido a fatores como a presença de contaminantes e a qualidade dos reagentes.

1. REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO
EM CADEIA (PCR)
PCR - consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os
elementos básicos do processo de replicação natural do DNA
ou cDNA.

2. O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da
década de 1980, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993,
atribuído o Prêmio Nobel de Química pelo seu trabalho.

3. Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation
patentearam este processo.
Bactéria Thermus aquaticus
(Taq-polimerase).

4. PRINCÍPIOS DA REAÇÃO DE PCR
A reação de polimerização em cadeia (“Polimerase chain
reaction”, PCR) é a técnica que permite a amplificação do
DNA ou cDNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma
reação enzimática catalizada pela polimerase (enzima
termoestável) cuja atividade depende de ions Mg++
Ocorre em 3 etapas:Ocorre em 3 etapas:
a) “Melting”(ou desnaturação que consiste na
separação da dupla fita do DNA a ser amplificado),
b) “annealing”( anelamento ou hibridização- ligação
do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado),
c) “extension” (extensão ou seja a polimerização
propriamente dita)

5. Depende:
Alternância de temperaturas a cada ciclo:
Replicação in vitro do DNA
• DESNATURAÇÃO
• ANELAMENTO
• POLIMERIZAÇÃO

6. Alternância de temperaturas a cada ciclo
1:Denaturaçao
94 ° C -96 ° C
Separa a fita dupla do DNA molde
em duas fitas simples
2.Anelamento:
37 ° C -65 ° C37 ° C -65 ° C
Primers se ligam aos sitios
específicos na fita simples
3. Extensão: 72 °
DNA polymerase acrescenta os
dNTPs à fita, de acordo com o
pareamneto de bases

7. Inicialmente é necessário que as duas
fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. A
elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove a
separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples.
Muitas vezes a temperatura de desnaturação é
determinada empiricamente e depende de alguns fatores
como a quantidade de guanina e citosina (GC) do
fragmento DNA alvo ou de interesse.
a)Desnaturação

8. A polimerase para anexar as bases complementares,
transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de
DNA já ligado na região previamente escolhida. Para isso adicionam-se, à
solução, os “primers” ou iniciadores que são pequenos fragmentos sintéticos
de DNA de fita simples, oligonucleotídeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de
comprimento, que são sintetizados in vitro baseado na sequência do DNA a
ser amplificado sendo eles complementares à seqüência do segmento de DNA
de interesse. Nas duas fitas surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA de
dupla fita intacta. A hibridização dos “primers” descrito como “Annealing”
(do inglês), deve ser feito a uma tempertura inferior à da desnaturação (45 a 70
°°°°C).
b) Anelamento-

9. - Quando os “primers” encontram e ligam-
se aos segmentos complementares, a DNA-Polimerase
liga os nucleotídeos entre si, completando assim as fitas
simples e tornando-as duplas (extensão). A DNA-
Polimerase não reconhece apenas o bloco de início
como também consegue diferenciar as duas
extremidades dos “primers” (3’ e 5’). Ela inicia a reação
sempre pela extremidade 3’ do “primer”, completando a
c) Extensão
fita simples daí em diante, portanto, sempre na direção
do fragmento procurado.

12. Automação da PCR
Um aparelho de PCR, ou um termociclador, repete o correspondenteUm aparelho de PCR, ou um termociclador, repete o correspondente
a programa de temperaturas. O operador deve apenas programar e
dar início para que transcorra a amplificação
Técnicamente muitas mudanças tem sido introduzidas melhorando
cada vez mais e ampliando a sua utilização.
Para cada situação experimental, novas modificações têm de ser
introduzidas, de tal forma que é muito difícil descrever um único
procedimento para um uso generalizado.
Por outro lado, é fundamental o conhecimento básico das etapas
envolvidas na técnica, para um desenho experimental com sucesso

13. É um seguimento de DNA ou RNA de 15 a 40 bases,
geralmente baseado na sequência já conhecida do
ácido nucleico, sintetizado quimicamente por
instrumentos automáticos, que podem ser adquiridos
no comércio para fins já definidos ou se escolhe a
região desejada do DNA ou RNA a ser amplificada.
Primer:
É um segmento de DNA ou RNA que foi marcado seja
com enzimas,, substratos antigenicos, substâncias
quimioluminescentes ou radioativas, que podem ligar-se
com alta especificidade a uma sequência complementar
do ácido nucleico alvo (escolhido).
Sonda (probe):

14. EFICIÊNCIA NA AMPLIFICAÇÃO:
Modelo teórico eficiência do processo de amplificação
corresponde a 100%, o que não é observado na prática.
Experimentalmente de 78% a 97%, dependendo do
fragmento amplificado.
Os principais problemas para a padronização:
a) Não detecção do produto,
b) Baixo rendimento do produto desejado,
c) Presença de bandas não específicas devido a “misextension” dos
“primers”,
d) Formação de dímeros dos “primers” que competem pela
amplificação com o produto desejado, mutação ou heterogeneicidade
devido a erro de incorporação.

15. Após cada ciclo, o número de fragmentos se duplica: de um
formando-se 2, e então novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128...
de tal forma que pode ser definida matematicamente por:
PCR REAÇÃO EM CADEIA
de tal forma que pode ser definida matematicamente por:
N = No ×××× 2n
N = número de moléculas amplificadas
No = número de moléculas iniciais
n = número de ciclos de amplificação

16. Primeiro Ciclo da PCR

17. Após sucessivos ciclos...

18. A polimerização é feita por uma DNA
polimerase termoestável = síntese
exponencial de moléculas de DNA.
São utilizados dois primers que delimitam
o segmento amplificado

19. Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir
dos primers serve como molde para a síntese de uma
nova fita. Isso garante o aumento exponencial do
número de novas fitas
Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR
tem a sequência dos primers na extremidade 5’ e atem a sequência dos primers na extremidade 5’ e a
sequência complementar aos primers na posição 3’.

20. Polimerização 5’ 3’
Todas as DNA-polimerasesTodas as DNA-polimerases
requerem para seu
funcionamento:
Molécula de DNA molde
Primer de oligonucleotídeos
Magnésio
dNTPs

21. Qualquer sequência alvo de DNA pode ser
amplificada por PCR
•A localização da sequencia-alvo é feita pelos primers.
• Oligonucleotídeos com 20-24 pares de bases são
seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um
genoma de alta complexidade.
• O pareamento dos primers com a sequencia –alvo se faz
pelo estabelecimento de pontes de hidrgênio, segundo
Watson e Crick

23. • Tampão:Mantém o pH ótimo para a atividade da
enzima
• Sais: fornecem condições ótimas para a máxima
eficiência da enzima. influenciam na cinetica de
hibridizaçao do DNA ou na Tm dos primers.
Componentes da PCR
• Magnésio (Mg++): ions de Mg são necessários para
estimular a Taq polimerase
Mg++: 1 a 4 mM

24. Cinética da PCR
•Fase de screening- ciclos iniciais
Os primers procuram o molde de DNA com as sequencias que lhes
são complementares . Encontrar a sequencia complementar não é
dificil, pois os primers estão em considerável excesso em relação
ao molde.
• Fase intermediária:
O processo de amplificação está ocorrendo levando ao acúmuloO processo de amplificação está ocorrendo levando ao acúmulo
exponencial do fragmento de DNA.O pareamento do primer com a
sequencia ja está facilitada, pois ja existem várias cópias da
sequencia-alvo
• Fase tardia ou fase de platô:
A amplificaçào ja é sub-ótima devido à limitaçao dos reagentes e a
competição dos produtos gerados com os primers disponíveis.

26. O aumento exponencial do no de cópias ocorre até um
determinado no de ciclos, que será variavel de reação para
reação.
Causas do platô (Desvio do ideal teórico):
• Perda de atividade da enzima
• Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de
DNA
• Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si,• Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si,
em detrimento do pareamento com os “primers”. Aumenta
possibilidade de amplificação de produtos inespecíficos.
• Gasto dos reagentes, especialmente de primers, mas também de
deoxinucleotídeos.
• Acúmulo de pirofosfato, resultante das ligações fosfodiésteres.
• Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados
com eficiência menor mas também foram se acumulando.

27. Fidelidade na PCR
• Fidelidade:
Acuracia na replicação
•Fidelidade na PCR
Alto % dos produtos da PCR tem seqüências idênticas ao alvoAlto % dos produtos da PCR tem seqüências idênticas ao alvo
• Alta fidelidade

28. Condições que afetam a fidelidade da PCR
Fatores Aumenta Fidelidade Reduz fidelidade
dNTPs Balanceado
40-50µM de cada
Desbalanceado
1-2mM de cada
Mg++ 1:1 com os dNTPs 6-8 mM Mg++
Temp. anelamento
Enzima ou tempo de
extensão
Ciclos

29. Otimização da PCR
• Aumenta a eficiência da reação (produção)
• Aumenta a especificidade
• Melhora a reprodutibilidade
Parâmetros a serem considerados na otimização
• Desenho de primers
Conteúdo de GC,
Evitar longas regiões ricas em GC ou AT,
Temperatura de anelamento (Tm – 4oC)
• Condições dos ciclos
• Concentração dos reagentes
•Componentes do tampão

30. Parâmetros dos ciclos:
1. Temperatura e Tempo de desnaturação
• Falta de desnaturação do molde é uma causa
comum de falha na PCRcomum de falha na PCR
• Tipicamente 94oC por 30 s
• Tempo de desnaturação muito longo reduz a meia vida
da enzima

31. Parâmetros dos ciclos:
2. Temperatura e Tempo de anelamento
• Temperatura de anelamento = 5oC abaixo do Tm real
dos primersdos primers
• Tempo de anelamento = 15 a 30 s
• Tempo de extensão: função tamanho do AMPLICON
– 1 minuto é suficiente 1,2 kb
– Longo, reduz a meia vida da enzima

32. DNA Polimerases Termoestáveis
Thermos aquaticus (Taq polymerase)
• Taxa de incorporação de bases erradas pode variar entre 10-3 a
10-6, dependendo das concentrações de Mg2+ e dNTPs
• A incorporação de base errada (mismatch) reduz a estabilidade
da interação da enzima com o DNA, favorecendo a interrupção
da polimerização.
• Baixa temperatura de extensão e elevada concentração de
dNTPs favorecem a extensão de primers com pareamento
imperfeito e a extensão após mismatch.

36. Inibem a PCR
•Contaminantes da amostra de DNA (limitante)
Inibidores da Polimerase
•Fenol
•Proteinase K•Proteinase K
•Agentes quelantes em excesso (EDTA)
•SDS
•Elevadas concentrações de sais