[1] A técnica de RFLP envolve a digestão do DNA com enzimas de restrição, seguida de eletroforese e hibridização com sondas marcadas para detectar variações genéticas. [2] O documento descreve o uso de RFLP e PCR-RFLP para identificar o criminoso em um caso de estupro no Rio de Janeiro com base no DNA. [3] O suspeito foi incluído como pai biológico do feto com alta probabilidade de paternidade de 99,9997%.

1. UNIVERSIDADE PRESIDENTE ANTÔNIO CARLOS
RFLP
Restriction Fragment Lenght
Polymorphism
Juiz de Fora, 09 de dezembro de 2011.

2. Grupo
• Bárbara Tuâne;
• Carlos Eduardo Cardoso;
• Marina Cognalato;
• Poliane Lopes.

3. Introdução
• A técnica de RFLP foi descrita inicialmete
por Botstein em 1980; RFLP é um dos
muitos tipos de marcadores moleculares,
e são capazes de detectar variações em
sequências de DNA de 4 a 8 pares de
base, reconhecidas por enzimas de
restrição, capazes de clivar DNA por
reconhecimento de sequências.

4. Marcadores Genéticos
• Qualquer característica morfológica ou
molecular que diferencia indivíduos, e que
seja facilmente detectável é um potencial
marcador genético.

5. Marcadores Genéticos
Marcadores moleculares
Morfológicos Bioquímicos DNA

6. Marcadores Dominantes

7. Marcadores Codominantes

8. RFLP
• São fragmentos de DNA obtidos de
enzimas de restrição, separados por
eletroforese e visualizados por meio de
hibridizações com sondas marcadas com
radioatividade ou fluorescência.

9. Etapas para aquisição de RFLP’s
• Extração do DNA;
• Digestão com endonucleases de restrição (cortam a
molécula de DNA através do reconhecimento de
sequências nucleotídicas específicas);
• Eletroforese;
• Transferência dos fragmentos para uma membrana de
nitrocelulose;
• Hibridização dos fragmentos com sondas marcadas;
• Visualização dos polimorfismos através de auto-
radiografia.

11. Base Genéticas dos Marcadores RFLP’s
• O polimorfismo observado na técnica de
RFLP ocorre porque o DNA de indivíduos
geneticamente distintos difere na
sequência de nucleotídeos ao longo da
fita.

12. Interpretação

13. Autoradiografia de uma
membrana de
hibridização revelando
marcadores RFLP.
Indivíduos homozigotos
para o alelo
A1(3,5,6,7,8,9) e
homozigotos para os
alelos A2(1,2,4).

14. Vantagens e Desvantagens
• Reprodutível;
• Marcadores co-dominantes;
• Simples.
• Trabalhoso;
• Caro;
• Uso de sondas radioativa.

15. Aplicações
• Mapeamento do Genoma;
• Genotipagem;
• Ciência forense;
• Teste de paternidade;
• Detecção de doenças hereditárias, etc.

16. Análise do RFLP para a Fibrose Cística

17. PCR-RFLP
(AFLP- Amplified Fragment
Length Polymorphisms)
• Isolamento de DNA suficiente para a análise RFLP é
demorado e trabalhoso. No entanto, a PCR pode
ser usado para amplificar pequenas quantidades
de DNA, geralmente em 2-3 horas, para os níveis
exigidos para a análise de RFLP. Portanto,mais
amostras podem ser analisadas em um curto tempo.

18. Artigo: Identification of a criminal by DNA
typing in a rape case in Rio de Janeiro,
Brazil.
A identificação humana por DNA é uma
ferramenta poderosa para casos de paternidade,
assim como investigação criminal pela tipagem de
evidências biológicas coletadas em cenas de crime
e identificação de restos mortais.

20. OBJETIVO: Identificação de criminoso em caso de estupro
com quatro suspeitos.
PARTICIPANTES: Sangue de quatro suspeitos e vítima e
pele do feto.
PROCEDIMENTOS: Reação em cadeia da polimerase
(PCR) e polimorfismo de tamanho de fragmentos de
restrição (RFLP).

22. RESULTADOS: Três suspeitos foram excluídos e um
suspeito foi incluído como pai biológico do feto.
Um teste complementar com 3 loci VNTR também foi
realizado.
O suspeito foi incluído como pai biológico apresentando
Índice de Paternidade de 412.860 (probabilidade de
paternidade: 99,9997%).

23. Conclusão
O desenvolvimento de técnicas baseadas
na hibridização de sequências de DNA abriu
novas opções para o estudo de variações . A
descoberta de enzimas de restrição, a
possibilidade de transferência de fragmentos de
DNA para membranas e o desenvolvimento de
novos métodos de marcação radioativa e
luminescente para fins de hibridização de
fragmentos de DNA determinaram o emprego
eficiente de RFLP em análise genética.

24. Bibliografia
• Artigo: GOES, Andréa Carla de Souza et al . Identification of a
criminal by DNA typing in a rape case in Rio de Janeiro, Brazil. Sao
Paulo Med. J., São Paulo, v. 120, n. 3, maio 2002 . Disponível
em <http://www.scielo.br/scielo>
• Livro: “Marcadores Genéticos Moleculares” – Fábio Gelape Faleiro
(2007);
• Livro: “Introdução ao Uso de Marcadores Moleculares em Análise
Genética” – Márcio Elias Ferreira & Dário Grattapaglia (1996);
• Livro: “Marcadores Moleculares em Plantas” – Sandra Milach (1998);
• Site: http://www.e-escola.pt/biologia;
• Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov;
• Site: http://www.sciencedirect.com/

25. Obrigado!