A técnica de PCR permite amplificar seletivamente segmentos específicos de DNA a partir de quantidades muito pequenas de material genético original. O processo envolve a repetição cíclica de desnaturação do DNA, emparelhamento de primers e extensão das cadeias por uma DNA polimerase termoestável. Isto resulta na replicação exponencial do segmento de DNA delimitado pelos primers, tornando possível analisar sequências genéticas em grande escala.

1. MÓDULO III
PCR

2. Reacção em
Cadeia da Polimerase:
fotocopiadora molecular
Laboratório Virtual de Biotecnologia
Introdução
O que é a técnica de PCR?
O desenvolvimento da Reacção em
Cadeia
da
Polimerase
(Polymerase
A PCR explora de uma forma
espantosa a função natural de um
Chain Reaction – PCR), em meados
grupo
dos anos oitenta, pode considerar-se
polimerases.
como uma revolução dentro de outra.
encontram-se presentes em todos os
Esta técnica veio possibilitar novas
seres vivos e têm como função copiar
estratégias de análise de genes no
o
âmbito
da
tecnologia
enzimas
denominadas
Estas
material
enzimas
genético
(além
de
de
DNA
corrigirem
anos
ocorrer durante o processo de cópia).
recombinante,
iniciada
nos
setenta.
técnica
permite
Esta
de
a
os
erros
que
podem
Uma reacção de PCR necessita
análise de quantidades ínfimas de
essencialmente
material genético o que possibilita um
sequência de DNA que se pretende
melhoramento das técnicas utilizadas
amplificar, de um par de sequências
no diagnóstico genético, investigação
nucleotídicas
iniciadoras
forense, sistemática, etc.
normalmente
são
De
acordo
com
presença
da
(que
denominadas
Hughes,
primers), de nucleótidos (A, T, G e C)
Director do National Center for Human
e de uma polimerase. Os primers são
Genome Research at the National
pequenas
Institutes of Health, a técnica de PCR
cadeia
“é a tecnologia mais importante dos
laboratório
últimos
empresas
anos”.
A
Mark
da
revista
Science
sequências
simples,
(ou
de
DNA
desenhadas
em
encomendadas
de
de
a
Biotecnologia
refere ainda que, por ser muito mais
especializadas),
simples
complementares às extremidades 3’
todas
e
as
menos dispendiosa
técnicas
que
anteriormente
do
segmento
que
de
DNA
são
relevante.
utilizadas na duplicação de DNA, esta
Assim, durante a reacção de PCR, os
técnica democratizou a investigação
primers irão flanquear a sequência
genética, colocando-a ao alcance de
que
todos os biólogos.
modo,
queremos
é
necessário
informação
sobre
DNA,
sobre
ou
amplificar.
a
obter
Deste
alguma
sequência
as
de
sequências
flanqueantes, para levar a cabo uma
2

3. reacção
de
misturados
amostra
PCR.
em
de
Os
primers
excesso
DNA
com
ciclo demora apenas alguns minutos
a
e, por isso, todo o processo é muito
a
enzima
Adiciona-se
polimerase.
e
são
ainda
magnésio (cofactor da polimerase) e
os nucleótidos.
rápido (Fig.1).
Desnaturação da amostra
para separar as cadeias de
DNA (95 ºC, 5 min.)
A reacção de PCR consiste numa série
de
ciclos,
cada
um
dos
quais
envolvendo três passos efectuados a
Emparelhamento
dos primers
(55 ºC, 30 s)
diferentes temperaturas:
A desnaturação (Passo 1) consiste na
incubação do DNA a uma temperatura
de 95 ºC para separar as cadeias
simples. Segue-se o emparelhamento
dos primers (Passo 2) que flanqueiam
Desnaturação
(95 ºC, 30 s)
o DNA, diminuindo gradualmente a
Síntese de DNA
(72 ºC, 2 min.)
Figura 1 – Um ciclo de PCR.
temperatura para cerca de 55 ºC.
Esta temperatura varia dependendo
da composição do primer e da sua
complementaridade com o DNA alvo.
Durante este passo, as duas cadeias
complementares
permanecem
do
DNA
desnaturadas
alvo
porque
estão em concentração baixa e não se
encontram para emparelhar. Como
estão
presentes
em
concentração
muito alta, os primers emparelham
com as regiões flanqueantes do DNA
alvo. Finalmente, para completar o
ciclo, é feita a síntese de DNA pela
DNA polimerase a uma temperatura
de 72 ºC (Passo 3). Esta enzima faz a
extensão dos primers, utilizando como
molde a cadeia a que cada primer
está emparelhado.
O ciclo de desnaturação (95 ºC),
emparelhamento (55 ºC) e síntese
(72 ºC) é repetido várias vezes. Cada
O resultado final é a amplificação
das sequências de DNA delimitadas
pelos
dois
primers
utilizados
na
reacção. Na prática obtém-se uma
quantidade enorme de um DNA alvo
partindo de uma mistura complexa
em que esta molécula pode estar
presente
como
cópia
única.
Esta
quantidade é suficiente para que o
DNA
possa
ser
directamente
visualizado num gel de agarose.
As temperaturas elevadas que se
utilizam durante cada ciclo de PCR
requeriam o uso de uma polimerase
estável, ou seja, de uma enzima que
não desnaturasse cada vez que fosse
exposta a temperaturas altas. No final
da década de 80 foi isolada a primeira
enzima
bactéria
bactéria
termoestável
Thermus
vive
a
partir
aquaticus.
junto
a
da
Esta
fontes
hidrotermais (cuja temperatura ronda
3

4. os
80
ºC)
designada
e
a
Taq
sua
polimerase,
DNA
polimerase,
O
aparecimento
polimerase
e
da
dos
Taq
DNA
termocicladores
mantém-se activa, mesmo quando
permitiu a proliferação desta técnica
exposta
a
de tal modo que, actualmente, está
temperaturas de 95 ºC, fazendo com
ao alcance de virtualmente todos os
que seja ideal para ser utilizada na
cientistas e estudantes.
repetidamente
PCR.
Quando esta técnica começou a
Aplicações da técnica de PCR
ser utilizada, os ciclos de temperatura
A PCR tem tido uma diversidade
eram obtidos através da transferência
de aplicações crescente. É utilizada
manual dos tubos da reacção entre
actualmente
diferentes
em
para ser directamente sequenciado ou
temperaturas
clonado; para mapeamento de genes;
recipientes
banhos-maria
específicas.
a
Esta
postos
actividade
era
para
para
amplificar
diagnóstico
de
DNA:
doenças
entediante para os cientistas e podia
hereditárias e doenças infecciosas;
provocar o aparecimento de erros,
para
uma vez que era difícil manter os
outros, para estudos moleculares de
banhos
evolução. Uma das capacidades mais
à
temperatura
ideal
e
estudos
forenses;
e,
entre
controlar bem os tempos de cada
surpreendentes
desta
banho. Este problema foi ultrapassado
capacidade
amplificar
quando
organismo extintos, alguns há vários
se
inventaram
termocicladores
os
automatizados.
de
técnica
é
DNA
a
de
milhões de anos.
Nestes, os tempos e as temperaturas
de cada fase do ciclo são introduzidos
no
computador
PCR: a fotocopiadora molecular
e
são
executadas
A técnica de PCR está a fazer com
sem
ser
necessário
o material genético o que a invenção
transferir os tubos da reacção de
da prensa fez com o material escrito:
recipiente em recipiente (Fig.2).
está a tornar acessíveis inúmeras
precisamente
cópias de material genético de um
modo rápido e barato. Em princípio
esta
técnica
material
pode
genético
reproduzir
de
o
qualquer
organismo em quantidades ilimitadas.
Deste modo, podemos analisar de um
modo simples o material genético de
qualquer
organismo,
incluindo
o
Homem.
Facilmente
vemos
as
inúmeras vantagens que esta técnica
Figura 2 – Termociclador automatizado.
4

5. trouxe à Biotecnologia, tendo quase
imediatamente ocupado um lugar de
destaque
em
inúmeras
áreas
da
investigação.
Questões de análise
No
Laboratório
Biotecnologia
Virtual
encontrará
de
uma
animação que ilustra e explica cada
etapa da técnica de PCR (canal 1 da
LVBtv).
1 – Descreva o que ocorre durante
um ciclo da técnica de PCR.
2 – Enumere as principais vantagens
desta técnica relativamente a outras
utilizadas
anteriormente
para
amplificar moléculas de DNA.
3
–
Faça
necessário
uma
para
lista
do
realizar
material
uma
experiência utilizando esta técnica.
4 – Indique as principais áreas onde
se pode aplicar esta técnica.
5

6. ALA METODOLÓGICA
Todos os pares de primers
Teoria:
amplificam do mesmo modo a
Conclusões:
mesma molécula de DNA?
Princípios:
Registos/Observações:
Pista 1
Conceitos:
Desenho experimental:
Material biológico
DNA alfa-C5
DNA beta-A7
Par de primers 1
Par de primers 2
Pista
1
Pista
2
Pista 2
6
ALA CONCEPTUAL

7. ALA METODOLÓGICA
Um par de primers
Teoria:
apresenta sempre o mesmo
Conclusões:
resultado,
Princípios:
independentemente da
molécula de DNA a
amplificar?
Registos/Observações:
Pista 1
Conceitos:
Desenho experimental:
Material biológico
DNA alfa-C5
DNA beta-A7
Par de primers 1
Par de primers 2
Pista
1
Pista
2
Pista 2
7
ALA CONCEPTUAL

8. ALA CONCEPTUAL
ALA METODOLÓGICA
Teoria:
Princípios:
amplificado está
dependente do número
Conclusões:
de ciclos de temperatura
que se efectua?
Registos/Observações:
Pista 1
Conceitos:
Desenho experimental:
Material biológico
DNA alfa-C5
DNA beta-A7
Par de primers 1
Par de primers 2
Pista
1
Pista
2
Pista 2
8
A quantidade de DNA