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Pcr 12
- 1. REAÇÃO EM CADEIADA POLIMERASE (PCR)
- 2. PCR Polymerase Chain Reaction Amplificação in vitro de uma seqüência específica de DNA * replicação in vitro
- 3. Aplicações da Técnicade PCR Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas Amplificação de genes para posterior clonagem e expressão Determinação de variabilidade genética Deteção de OGMs Sexagem de embriões Estudo da expressão gênica
- 4. História Kary Mullis(1983) Prêmio Nobel Química (1993) Revolucionou genética pesquisa genética medicina forense genética molecular
- 5. Componentes da reação DNA molde Oligonucleotídeos (primer) dNTP’s DNA Polimerase Magnésio Tampão Água
- 6. Equipamento TERMOCICLADOR
- 7. CICLOS Programa PCR 94 0C por 5 min 94 0C por 1 min 55 0C por 1 min 35 ciclos 72 0C por 1 min 72 0C por 5 min 4 0C
- 8. ETAPAS -Extração de DNA -Desenho dos Primers -Reação de PCR - Análise dos resultados
- 9. Obtenção do DNAgenômico
- 10. DELINEAMENTO DE PRIMERS Os iniciadores (oligos / primers) são a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR. - Tamanho dos primers; - Estabelecimento das temperaturas corretas a serem utilizadas;
- 11. DELINEAMENTO DE PRIMERS PrimerForward 5’ TAGAAGCTTCCAGCCATGAACTCAG 3’ Tm: 57.9 Enzima: Hind III Anelamento: 16 nt Total primer: 25 nt Primer Reverse 5’ ACGGAATTCTCAGAGTGCAGTTTG 3’ Tm: 56.4 Enzima: Eco RI Anelamento: 15 nt Total primer: 24 nt
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- 13. ETAPAS DA PCR 30-60C
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- 18. Eletroforese em Gelde Agarose
- 19. Eletroforese em gelde agarose
- 20. Visualização do DNAem luz ultravioleta
- 21. Resultados Eletroforese do DNAem gel de agarose 0.8%
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- 23. Limitações Extração doDNA da amostra é crítica Alguns compostos podem inibir a polimerase Condições específicas para cada reação Falsos resultados positivos devido a contaminação. Falsos resultados negativos. Análises conduzidas em laboratórios especializados.
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- 25. Tipos de PCR ·AFLP ·PCR-ELISA ·Alu-PCR ·PCR-RFLP ·Asymmetric PCR ·PCR-SSCP ·Colony PCR ·QC-PCR ·DD-PCR ·RACE ·Degenerate PCR ·RAPD ·Hot-start ·Real-Time PCR ·In situ PCR ·Rep-PCR ·Inverse PCR ·RT-PCR ·Long-PCR ·TAIL-PCR ·Multiplex PCR ·Touchdown PCR ·Nested PCR ·Vectorette PCR
- 26. Aditivos PCR Additivos DMSO(dimethyl sulfoxide) genomas ricos em GC Formamide Non-ionic detergents –Triton X 100 Tween 20 or NP-40 TMAC (tetramethylammonium chloride) BSA (bovine serum albumin)