O documento descreve o processo de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que permite amplificar seletivamente fragmentos de DNA. A PCR usa primers, nucleotídeos e a enzima DNA polimerase para replicar um pedaço específico de DNA in vitro, gerando milhares de cópias do fragmento. O processo consiste em ciclos de aquecimento, arrefecimento e extensão para replicar o DNA alvo.

1. Reação em cadeia da polimerase
Grupo:
Caique Moreira 10158
Guilherme Victor 10167
Gustavo Assis 10169
Laura Lassance 10176
Pedro Chinen 10186
Rubens 10190
3º Informática

9.  Paraquê?
Criar facilmente milhares
de cópias de um único
pedaço de DNA
 Onde?
In vitro

10.  Do que precisa?
 Um pedaço do DNA desejado
 Dois primers (DNAs iniciadores)
diferentes
 Nucleotídeos (adenina - A, guanina –G,
citosina - C e timina - T)
 Enzima DNA polimerase (enzima que
faz replicação do DNA)

11. O que são primers?
 Fitas de DNA
 Mais ou menos 20 bases nitrogenadas
(A, T, C, G) complementares ao início
da sequência de DNA alvo
 São usados dois diferentes, pois as
“pontas” das fitas de DNA base são
diferentes

12. • No tubo de ensaio:
 Amostra de DNA
 Primers (oligonucleótidos) complementares
 DNA polimerase
 Nucleotídeos

13.  Uso da máquina de PCR (máquina que aumenta e
diminui a temperatura de acordo com um
programa)
 Passos seguintes:
dentro da máquina

14.  Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar
(separar a dupla fita) o DNA.

15. • Fita simples do DNA desnaturado: molde
• Resfria-se a 54ºC
• Primers
• Anelam-se ao início das duas fitas simples
• Iniciadores para a enzima polimerase

16.  Tuboa 72ºC (temperatura ideal de
funcionamento da DNA polimerase)
 Cofator enzimático Mg2+, do MgCl2
 Duplicaçãoda fita, a DNA polimerase começa
seu trabalho  formação de nova fita dupla

17. Taxa de replicação:
2 ciclos
(exponencial)
Vídeo:
http://www.ib.usp.br/microg
ene/atividades0popup.php?Ar
quivo=atividades-5-
Arquivo.swf

18.  Do que precisa?
 Dideoxinucleotídeo trifosfato
(dNTPs; nucleotídeos contendo grupos
trifosfatos), os blocos de construção
com os quais a DNA polimerase sintetiza
uma nova fita de DNA

21. Inibem a PCR
 Contaminantes da amostra de DNA (limitante)
Inibidores da Polimerase
 Fenol;
 Elevadas concentrações de sais;

22. ELETROFORESE
 Identifica tamanho dos fragmentos (produtos)
 Carga de uma fita de DNA é negativa
 Corrente: carga negativa atraída por cátodo
(positivo)
 “Peneira”
(gel de agarose) – dependendo do
tamanho viaja ou não pelos poros
 Distância percorrida comparada com Ladders

23. ELETROFORESE

25.  Determinar sequência de nucleotídeos
 Dna e Rna
 Sequenciamento Químico(Maxam – Gilbert)
 Sequenciamento Enzimático(Sanger-Coulson)

26.  Final
do trecho de DNA Selecionado é marcado
com fósforo 32P
 Moléculaserá decomposta em pontos específicos,
sendo dividida em bases nitrogenadas C, G, G+A e
T+C
 Porfim os fragmentos são analisados por migração
causada por eletroforese causada pelo gel de
policrilamida.

30.  LABELLING REACTION

31.  TERMINATING CHAIN REACTION

32.  Uso
de enzima polimerase para catalisar reação
em cadeia
 NaSequenciação não é preciso acumular DNA
duplicado, logo é usado apenas um primer

37.  Quantidade DNA disponível é reduzida;
 Em teoria, com o PCR é possível amplificar a
quantidade de qualquer DNA;
 Medicina forense;

38.  Identificação de doenças hereditárias;
 Construção de árvores filogenéticas;
 Clonagem de genes;
 Teste de paternidade;
 Detecção de organismos causadores de infecções;
 Concepção de organismos transgênicos.
 Sequenciamento gênico de animais pré-históricos;

39.  Atualmente aumentou o número de co-
infecção tuberculose e HIV;
 Letalidade da tuberculose pode ser 2,4 a 19 vezes maior;
 PCR utilizado para o diagnóstico da
tuberculose;

40.  http://www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades
 http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/PCR.php
 http://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_pol
imerase
 http://www.infoescola.com/genetica/reacao-em-cadeia-da-
polimerase/
 http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
 http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=339
 http://www.imt.usp.br/portal/images/pdf/proto/aula1.pdf
 http://www.icb.ufmg.br/mor/pad-morf/pcr2.htm
 Rev. Saúde Pública, 33 (3) p. 281-6, 1999