O documento discute como as mutações em microrganismos geram variabilidade e contribuem para a evolução. As principais formas de variação genética incluem mutações, recombinações e aquisição de novos genes. Os mutantes auxotróficos, resistentes a antibióticos e com alterações morfológicas são úteis para estudos genéticos de microrganismos.

1. MUTAÇÕES EM
MICROORGANISMOS
Tipos, isolamento, caracterização e a natureza da
variação

2. Como é os microorganismos evoluem?
 Alterações na sequência dos genes podem ocorrer e resultar em
alterações no fenótipo.
 Importantes para gerar variabilidade e contribuir, assim, para o
processo de evolução dos microrganismos.
 Evolução requer variabilidade
 Requerendo a evolução variabilidade, face a uma mudança brusca
no meio ambiente, as bactérias e outros microrganismos possuem
um conjunto de mecanismos geradores de alterações genéticas que
conduzem a variantes, fornecendo-lhes assim a possibilidade de
ultrapassar situações que ponham em risco a sua sobrevivência.
 As variantes com características que melhor se adaptam à nova
situação são selecionadas e sobrevivem em detrimento das menos
adaptadas.

3. Principais mecanismos que geram variabilidade,
contribuindo assim para a evolução
 Variações no Genótipo:
 Mutações
 Recombinações
 Aquisição de novos genes
 Rearranjos intramoleculares (translocação e inversão)
 Variações no Fenótipo (características visíveis):
 Indução enzimática
 As recombinações do DNA e as mutações são os
mecanismos que mais contribuem para a evolução.

4. Obtenção de mutantes
 Como estudar um ser vivo geneticamente?
 Tipo original (tipo selvagem) x mutantes
 Importante para estudo genético em
microorganismos
 Diferentes tipos com caracteristicas hereditárias
distintas e bem definidas

5. Clones em microorganimso
 Origem de uma única célula
 Divisão celulares
 Progressão geométrica
 Muitas células = colônias em meio de cultura
sólidos;
 Colônia visível a olho nu = clone = grupo de células
todas iguais geneticamente

6. Mutações em microorganismos
 Mutações letais, quando expressas, resultam na morte do
microrganismo.
 Mutações condicionadas, são as que são expressas apenas em
determinadas condições ambientais, por exemplo, mutações de
letalidade condicionada na E. Coli, podem ser expressas a altas
temperaturas, mas não a baixas temperaturas; esse hipotético
mutante (termossensível) crescerá então normalmente a baixas
temperaturas, mas a altas temperaturas poderá morrer.
 U tilizam-se mutantes termossensíveis quando se quer atingir um
gene que é essencial à integridade e viabilidade da célula. Ex. gene
da DNA polimerase.

7. Mutações Bioquímicas
 Mutações bioquímicas são mutações que causam uma
mudança na bioquímica da célula, causando
frequentemente deficiência ou mesmo inativando uma via
biossintética da bactéria, ou seja, é eliminada a capacidade
da bactéria sintetizar uma macromolécula essencial, como
aminoácidos ou nucleótidos.
 Os microrganismos que sofrem esta alteração são
chamados mutantes auxotróficos, dizem-se auxotróficos
para a molécula que não conseguem sintetizar.
 Um outro tipo de mutantes bioquímicos são os chamados
mutantes resistentes. Estes organismos sofrem mutações
e adquirem resistência a agentes antimicrobianos, como
antibióticos.

8. Tipos de mutantes
 Mutantes auxotróficos
 Mutantes incapazes de utilizar certas fontes de carbono e nitrogenio
 Mutantes resistentes a agentes inibidores
 Mutantes morfológicos
 Mutantes para produção de substancias liberadas pelas celulas
 Mutantes para locomoção e comportamento
 Mutantes para patogenicidade
 Mutantes mais sensíveis a agentes inibidores
 Reversões
 Mutantes em vírus

9. Mutantes auxotróficos
 Crescimento em meio definido ou mínimo – sais
minerais, fonte de carbono, aminoácidos, vitaminas e
outros componentes de natureza conhecida.
 Crescimento em meio completo – peptona, extrato de
levedura, caseína hidrolisada, extrato de carne
 Microrganismos que não crescem em meio mínimo, em
oposição à linhagem original, chamada de prototrófica.
Se um mutante auxotrófico não for capaz de crescer em
meio mínimo, mas crescer em meio completo ou mesmo
em meio mínimo adicionado de um aminoácido, por
exemplo, triptofano, esse mutante é chamado de
triptofano
deficiente nutricional para a síntese de triptofano,
triptofano – ou trp- .

10. Mutantes deficiente por sinteses
Convenciona-se três letras minúsculas:
Lisina – lys¯
Prolina – pro ¯
Biotina - bio ¯
 Vários genes para mesma síntese: 1 letra maiúscula é adicionada
Ex. 3 genes que afetam a síntese de triptofano: trpA, trpB e trpC
 Vários mutantes do mesmo gene: designados por números:
trpA1, trpA2, trpA3, etc.
Essa nomenclatura é convencionada para todos os tipos
de mutantes em microorganimos

11. Auxotróficos parciais
“leaky” = sintetiza somente uma pequena
quantidade do componente essencial, parte é
´vazada` para fora da célula.
Estratégia para a geração de clones
condicionalmente gene alvo. CDNAs
Ts mutante de um gene de interesse
pode ser projetado com base nas
informações dos mutantes ts
fermento, se disponível. Seguindo o
protocolo padrão para gerar ts
células mutantes, cada cDNA
mutação é introduzido por uma
integração orientada para o locus
endógenas do gene em células DT40
heterozigotos (+/-) mutante. As
células resultantes devem ser
homozigotos (-/-) células mutantes e

12. Mutantes incapazes de utilizar certas
fontes de carbono e nitrogênio
 Bacterias e fungos capazes de utilizar varias
fontes de carbono: glicose, galactose, lactose,
maltose, acetato e outras.
 Mutantes para fontes de C em bactérias têm a
vantagem de serem distinguíveis
morfologicamente em certos meios especiais
com adição de corantes.
 Mutantes são incapazes de usar galactose (gal¯)
tipo selvagem (gal+)

13. Mutante que não usa lactose
 Mutantes lac- em E. coli apresentam
coloração rosada em meio com eosina e
azul em meio de metileno, enquanto os
selvagens são colônias de coloração
vermelho-brilhante
 Tipo seilvagem : lac+

14. Mutantes incapazes de utilizar fontes
de nitrogenio
 Utilizados em fungos
 Incapazes de utilizar nitrato ou amonia
 A classificação dos mutantes, de acordo com a via de utilização do nitrato,
em nit1, nit2, nit3 e nitM, será realizada de acordo com BROOKER et al.
(1991)
Hipoxantina Xantina Ácido úrico
Purina desidrogenase
nit M
Co-fator Molibdênio
Nitrato Nitrito
redutase redutase
Nitrato Nitrito Amônio
nit1 nit3
Via de utilização de nitrato no metabolismo de fungos

15.  Obtenção e caracterização dos mutantes não
utilizadores de nitrato (mutantes nit)
6 mm
Extrato de malte 3,5% +
KClO3 1,5%
10
Isolados com
dias
crescimento ralo, com
pouco ou nenhum
micélio aéreo
Meio mínimo
Mutantes nit

16. Mutantes nit
Nit1 Meio básico + NaNO3
nit2 Meio básico + hipoxantina
nit3 Meio básico + NaNO2
nitM Meio básico + tartarato de amômio

17. Mutantes resistentes a agentes inibidores
 Em bactérias, os mutantes resistentes a antibióticos e
quimioterápicos são largamente utilizados não só
para estudos básicos de genética como pela sua
importância aplicada.
 Mutantes resistentes:
 Estreptomicina – strR
 Tetraciclina: tetR
 Cloranfenicol: chlR


18. Inibidores de crescimento de
microorganismos
 Em fungos, são bem conhecidos os mutantes
resistentes a acertos fungicidas:
 Benomil: benR
 Cloronel: chlR
 Corantes como acriflavina AcrR
 Os inibidores ainda incluem outros componentes :
 Metais pesados (mercúrio, arsênio, cobre, zinco, cálcio, etc.)
 Agentes biológicos (vírus)
 Agentes físicos (luz UV, temperaturas elevadas)

19. Mutantes morfológicos
 Mutações morfológicas modificam a morfologia
(forma) da colônia ou da célula do microrganismo.
 Aqueles que apresentam modificações:
 Coloração
 Tamanho
 Formato da colônia
 Formação de estruturas
 Formação de conídeos

20. Mutantes “minute” ou “petite
 Colônias menores que a linhagem original,
largamente empregados em fungos, leveduras
Eletromicrografia de Células leveduras.
(A) estrutura das mitocôndrias normais.
(B) mitocôndria em um mutante petite.
Em mutantes petite, todos os produtos de
genes mitocondriais codificadas estão
faltando, a organela construida
inteiramente a partir de proteínas do
núcleo-codificado.

21. Topotecano (TPT) é capaz de induzir petite e se
acumula na mitocôndria.
(A) Teste da gota para testar o efeito do
tratamento TPT sobre o crescimento do
fermento. O indicador foram expressas sob
controle do promotor GAL1 e as células foram
cultivadas em placas com ou sem 20 mg / ml
TPT. Note-se que petite induzida em
galactose pela expressão de mt125Top1-103
sob o controle do GAL1p cresceu mais
lentamente do que petite induzida em
galactose pela expressão de mt125Top1-103
sob o controle do MET25p.
(B) Localização intracelular da CPT e TPT.
Usando as configurações para a detecção de
DAPI, a TPT intracelular e localização CPT foi
determinada pela sua auto-fluorescência.
pRWE129 foi expressa para GFP-local do
núcleo. CPT é principalmente enriquecido em
vacúolos, enquanto TPT a coloração de
fluorescência (seta branca). Barra branca
representa 5 mM. de la Loza M C D , Wellinger R E Nucl. Acids Res.
2009;37:e26-e26
© 2009 The Author(s)

22. Mutantes com colônias com bordos enrrugados
Experimento sobre a
transformação pneumocócica:
(a) ratos são resistentes ao tipo
de bactéria Streptococcus
pneumoniae R, (b) são mortos
por injeção com virulência de
bactérias do tipo S; (c) com
injeção de calor bactérias
virulentas mortas não matam
ratos, mas (d) Tipe S bactérias
são misturados com bactérias
não-virulenta Tipo R, eles têm a
capacidade de transformar não-
virulenta Tipo R em virulenta
Tipo S .

23. Mutantes com baixo crescimento de hifas e
não formação de conídios
Fenótipo de um Neurospora crassa rho-4
mutante.
(A) Hifas de N. crassa do tipo selvagem e
conídios após 5 dias de crescimento em
placas. (B) Um mutante rho-4 na forma de
micélio fino com manchas de vazamento de
citoplasma (setas pretas) e sem conídios.
(C) Hifas N. crassa do tipo selvagem
corados com calcofluor (1 mg / ml), mostram
coloração brilhante nas paredes e septos
celulares. Uma seta aponta para um conídio.
(D) rho-4 mutante hifas coradas com
calcofluor (1 mg / ml) da parede celular
mostram coloração, mas não septadas e
sem coloração. rho-4 mutantes sofrem
fusão celular. Área marcada de evento
recente fusão celular. Coloração de
calcofluor não apresenta um septo, mas a
Neurospora crassa parede celular das hifas intervir de fusão,
que é degradada após a conclusão da fusão
de hifas. Bar, 10 mM.

24. Fenótipos úteis em Genética Bacteriana
 Sabe-se que, mudanças na estrutura das proteínas
podem levar a mudanças nas suas funções que, por
sua vez, podem alterar o fenótipo de um
organismo (as suas propriedades visíveis).
Aspecto das colônias.
Esta figura evidencia como o aspecto
das colônias da mesma bactéria é
diferente consoante se trate de um WT
(wild type) – organismo não mutante –
ou de um
organismo mutante.
Wild type (WT) é a forma prevalente de
um gene e o seu fenótipo associado

25. Serratia marcescens
WT
Fotografia de estirpes do tipo selvagem de Serratia marcescens ATCC 274, Serratia sp. ATCC
39006 e Serratia sp diferente. ATCC 39006 mutantes biossintéticos cultivados em meio peptona
glicerol. As cepas são indicados (a partir do topo, em sentido horário), Serratia 39006 mutante
biossintético, Serratia 39006 tipo selvagem, três Serratia 39006 mutantes biossintéticas e S.
marcescens ATCC 274 do tipo selvagem. As bordas pigmentadas dos três mutantes biossintéticos
na metade inferior do resultado da placa de ágar a partir de onde ocorre a alimentação cruzada de
intermediários.

26. Staphylococcus aureus
 Formação de biofilmes por estirpes de
S. aureus em poliestireno:
(C) Em pocinhos de vidro
(D) Biofilme bacteriano formado durante o
cultivo de noite em placas de poliestireno
foram coradas com safranina.
(E) Poços: 1) S. aureus ATCC 35556 do tipo
selvagem, 2) icaADBC mutante; 3) dltA
mutante; 4) dltA mutante complementada
com pRBdlt1 plasmídeo, 5) S. TM300
carnosus.

27. Aspergillus nidulans
 Fungo com conídios de coloração verde,
os mutantes amarelos, brancos
 Aspergillus nidulans oferece um
excelente sistema experimental.
 É fácil de cultivar em laboratório, gera
mutantes haplóides e podem ser
facilmente isoladas e tem um bom
sistema genético.
 Uma variedade de ferramentas
moleculares, incluindo um sistema de
transformação nos permitem manipular
sequências in vitro e então re-introduzir
o DNA no organismo.
 A seqüência do genoma de Aspergillus
nidulans já está disponível.

28. Mutantes para produção de substâncias liberadas
pelas células.
 Bacillus, Streptomyces, brevibacterium e fungos do genero
Penicilliume Aspergillus: liberam antibióticos, ácidos orgânicos,
enzimas , aminoácidos, vitaminase outras usbtanciuas
 Mutantes incapazes de liberar ou que liberam em excesso certos
componentes (ácidos orgânicos, enzimas, amino-ácidos,
vitaminas).
 São de grande importância par estudos genéticos e para a
indústria.
 Ex. Penicillium – produção de penicilina

29. Mutantes para locomoção e comportamento
 Ausência de flagelos:
 Mutantes mot¯: perdem a capacidade de locomoção
 Mutantes che¯: têm comportamento alterado em
comparação com o tipo original em relação à
quimiotaxia

30. Mutantes para patogenicidade
 Isolamento de microorganismos não patogênicos
obtidos de formas patogênicas
Mutantes de Meganasporte grisea I-22
cultivados em meio completo

31. Reversões
 Mutação reversa pode ocasionar a volta das
características originais.
 Pode ser verdadeira ou ocasionada por supressão
dentro do gene mutado (intragênica) ou por outro gene
que não o mutado (intergênica)
 Reversão de auxotrofia para prototrofia é usada para
detecção de substâncias mutagênicas, pratico para
estimar o numero dessas reversões.
 Utiliza-se o meio mínimo que não possibilita o
surgimento de mutante original, mas permite o
aparecimento e contagem de colônias reversas.

32. Detecção, Seleção e Isolamento de mutantes
 Gerar e isolar microrganismos mutantes revela-se muito
importante, pois o seu uso e estudo no laboratório e na
indústria é de grande interesse.
 As bactérias são excelentes modelos para estudar os
mecanismos moleculares subjacentes ao aparecimento de
mutações, devido ao fato de serem organismos haplóides, isto
é, possuem uma única cópia de cada um dos genes que
formam o seu genoma.
 Assim, qualquer mutação adquirida é imediatamente
expressa na geração descendente conduzindo diretamente a
uma alteração fenotípica, ou seja, uma mudança de uma
característica observável numa espécie, como já foi referido.

33. Como estudar os microrganismos?
 Primeiro têm de ser detectados isolados eficientemente dos
organismos wild type e de outros mutantes sem interesse.
 Passa-se agora à descrição de algumas técnicas usadas na
sua detecção, seleção e isolamento.
 Como o código genético é degenerado, há mutações que não
modificam as propriedades de uma estirpe bacteriana.
 A detecção de mutantes numa população Mutantes
auxotróficos
 Fenótipo condicionado à presença ou ausência da
macromolécula não sintetizada
 Mutantes resistentes a agentes antimicrobianos

34. Caracterizar mutantes
 Quando se pretende obter mutantes de um determinado microrganismo, é
necessário a partida, ou seja, as suas características normais – as
características do wild type – para assim se reconhecer o fenótipo alterado.
 Os mutantes podem ser detectados muitas vezes de uma forma direta –
através da observação visual da cor da colônia, ou de uma forma mais
complexa, como é o caso da técnica utilizada para detectar e isolar mutantes
auxotróficos.
 A técnica deve permite a distinção entre mutantes e linhagem wild type, tendo
por base a sua capacidade de crescimento na ausência de um produto final
biossintético particular.
 Os mutantes lisina auxotróficos, como não têm a capacidade de sintetizar o
aminoácido lisina, não vão crescer num meio mínimo sem lisina (meio sem
quantidades adequadas de lisina) mas vão crescer num meio mínimo com este
aminoácido.

35. Técnicas para isolamento e caracterização de
mutantes

36. Como se procede então para isolar os mutantes lisina
auxotróficos?
 Geram-se os mutantes tratando a cultura com um agente mutagênico;
 Semeia-se a cultura contendo mutantes auxotróficos e Wild Type numa
placa de Petri com meio completo e deixa-se incubar;
 Depois das colônias se desenvolverem, coloca-se um veludo estéril na
superfície da placa de Petri e transferem-se as bactérias para duas
placas de petri diferentes.
 As bactérias são semeadas para as duas placas na mesma posição que
se encontravam na primeira placa;
 Após incubação, verifica-se que há colônias que cresceram no meio
mínimo com lisina, mas que não cresceram no meio mínimo sem lisina –
são lisina negativas (mutantes);
 Determina-se então a localização destes mutantes (Lys -) e são depois
isolados.

37. Isolamento de mutantes auxotróficos. (Lisina negativos)
Nas culturas em especial, alguns gêneros de enterobactérias.

38. Isolamentos dos mutante
 A retirada dos mutantes é efetuada após a sua detecção, pode apresentar
alguns problemas práticos, pelo que se deve recorrer a eficientes sistemas de
seleção, que utilizam fatores ambientais para separar os mutantes da linhagem
wild type.
 As técnicas utilizadas para efetuar a seleção envolvem condições de incubação
que favorecem o crescimento do mutante, enquanto que o wild type não é
favorecido.
 Muitas vezes, as células wild type são susceptíveis ao ataque de vírus (Figura 1),
ou ao tratamento com antibióticos (Figura 2), sendo assim possível fazer
crescer a bactéria na presença de um desses agentes e observar microrganismos
sobreviventes.

39. Resistência aos Bacteriófagos
 Figura 1 – Resistência aos
Bacteriófagos.
 Bacteriófagos (Fagos) são
vírus que lisam e portanto,
matam as bactérias.
 Ao expor-se uma cultura de
E.Coli num meio contendo o
agente seletor Fago T2 e
incubando-se depois,
verifica-se que resistem 4
clones - são os mutantes
resistentes a esse fago

40. Resistência a antibióticos
 Considerando o exemplo
de bactérias wild type
sensíveis ao antibiótico
estreptomicina:
 Como se procede para
selecionar mutantes
resistentes a esse
antibiótico?
Figura 2. Mutantes resistentes ao antibiótico estreptomicina.

41. Seleção de mutantes resistentes a
antibiótico
 Coloca-se em contato com o antibiótico (estreptomicina neste caso) a
cultura de microrganismos contendo mutantes resistentes ao mesmo; morrem
todas as colônias exceto as resistentes ao antibiótico;
 Faz-se a seleção positiva dos mutantes bacterianos com um agente de
seleção – estreptomicina - ou seja, põe-se de novo em contacto o
antibiótico com os mutantes resistentes ao mesmo e incuba-se.
 Apenas se desenvolve a linhagem de microrganismos que não reverteu à
mutação, ou seja, apenas se desenvolvem os microrganismos que
continuaram com a mutação após contacto sucessivo com o antibiótico –
são os resistentes ao mesmo.
 Assim, selecionam-se os mutantes resistentes em detrimento dos mutantes
que, nalguma geração, reverteram à mutação, ou seja, nalguma geração
deixaram de a ter.

42. Quebra de resistência
 Esta técnica é importante na Quimioterapia, uma vez que, como é sabido,
não se deve abusar dos antibióticos pois, como demonstrado nesta técnica,
ao expor-se o antibiótico aos microrganismos de um modo sucessivo, vão-
se eliminando os que não são resistentes, ficando apenas os que resistem,
que poderão então crescer e multiplicar-se de uma forma mais eficaz.
 Também pode ser utilizada esta técnica de seleção no isolamento de
reversíveis à lisina auxotróficos (Lys -). Coloca-se uma população destes
microrganismos num meio sem lisina e deixa-se incubar. Examinando
depois o desenvolvimento e formação das colônias, verifica-se que apenas
as células que reverteram à mutação cresceram, pois têm a capacidade
de sintetizar lisina.

43. Teste de flutuação
 As mutações ocorrem
independentemente ou
dependentemente do
agente seletor?
 Será que é necessário o
contacto com o agente
seletor para surgir a
mutação, ou esta surge
espontaneamente,
acontece?
 Para se saberem estas
respostas realiza-se o
teste de flutuação.
Figura 5 – Teste de Flutuação: 1a experiência (controle) e 2a experiência

44. 1a experiência
 Tem-se um caldo de
bactérias do qual se
tiram alíquotas iguais e
semeiam-se em vários
meios iguais com o mesmo
agente seletor (Fago T1);
 Incuba-se. Após
incubação, observa-se
que houve formação de
colônias, mas a sua
quantidade é constante
ao longo de todas as
placas, ou seja, houve
pouca flutuação no
número de colônias.

45. 2a experiência:
 Em vários tubos coloca-se a
bactéria, onde a replicação
de cada um é
independente;
 Fazem-se espalhamento dos
tubos onde existe 109
bactérias para placas com
fago T1;
 Incuba-se.
 Após incubação obtém-se
uma flutuação do número
de colônias resistentes nas
placas.

46.  Não se obtém o mesmo resultado em todas as placas ou seja, o resultado
é diferente em cada tubo. Isto mostra então que as mutações ocorrem
independentemente do contacto com o agente seletor (neste caso o fago
T1). Não é por não haver contacto com o agente seletor que deixa de
haver mutações de resistência. Então, a que se deve a variação?
 As mutações ocorrem espontaneamente, quando ocorre a replicação do
DNA durante o crescimento. São variáveis, aleatórias, não precisam do
agente seletor, é uma questão de probabilidade. Neste caso, ocorreram
várias mutações de 103 bact./mL para 109 bact./mL.
Figura 6 – Teste de
flutuação. Quanto mais
cedo ocorre a mutação,
maior será o número
de mutantes nas
Caixas.

47. Avaliações de mutações
 Taxa de mutação é o número de mutações de um fenótipo
particular que ocorreram numa cultura em crescimento, dividido
pelo número total de gerações celulares (divisões) no mesmo
intervalo de tempo.
 TM = número de bactérias resistentes (mutantes) /Número de
gerações celulares
 a – taxa de mutação
 m – número médio de mutações que ocorreram na cultura
 N – número total de divisões celulares

49. Informações sobre a taxa de mutações
 O conceito de taxa de mutação é muito importante
porque nos dá a probabilidade de ocorrência de
mutações.
 Perceber esta probabilidade é também muito
importante para detectar bactérias resistentes a um
antibiótico e prever, assim, a sua eficácia.
 Se a probabilidade é baixa, o antibiótico é bom, se por
outro lado, a probabilidade de ocorrência de mutações
é elevada, o antibiótico não é muito bom.
 Conclui-se assim que a taxa de mutação é muito útil
para se avaliar a performance de um futuro
antibiótico.

53. Mutantes em vírus