Este documento descreve uma análise de RNA-Seq da resposta ao choque térmico em Moraxella catarrhalis. A metodologia incluiu o cultivo de duas cepas de M. catarrhalis em 26°C e 37°C, preparação de RNA, sequenciamento e análise de dados. Os resultados mostraram que 831 genes foram diferencialmente expressos a 26°C, envolvendo funções como transcrição, metabolismo de lipídios e biossíntese da membrana.

1. RNA-Seq-based analysis of the physiologic
cold shock-induced changes in Moraxella
catarrhalis gene expression.
Autores: Spaniol V., Wyder S., Aebi C.
Apresentação: Vitor Lima Coelho
Laboratório Nacional de Computação Científica
Ministério de Ciência, Tecnologia e Inovação
Petrópolis, Rio de Janeiro - Brazil

2. Tópicos
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•
•
•
Introdução
Metodologia
Resultados e Discussão
Considerações finais

3. INTRODUÇÃO

4. Moraxella catarrhalis
• Encontrada no trato respiratório superior
• Causadora de infecções:
• Sinusite, conjuntivite, bronquite crônica, etc.
• Estudos clínicos revelam a sazonalidade das
infecções e sua intensificação em períodos de
inverno

5. Moraxella catarrhalis
• A flora da nasofaringe humana é exposta
repetidamente à alterações súbitas de temperatura
• Choque frio pode ser clinicamente relevante durante
períodos de clima frio pelo aumento temporário da
virulência do organismo
Fonte: http://www.bacteriainphotos.com/Moraxella%20catarrhalis%20light%20microscopy.html

6. Cepas da bactéria e condições de cultura
RNA: preparação
Análise de dados de RNA-Seq
Análise estatística
METODOLOGIA

7. Cepas da bactéria e condições de cultura
• M. catarrhalis O35E
• M. catarrhalis isolada clinicamente 415
• Cultura:
• 37º C
• 200 rpm em BHI (DifcoTM) ou placas de ágar em uma atmosfera
contendo 5% CO2
• Alteração de temperatura da cultura:
• Culturas expostas a 26oC e 37oC
• Duração: 3 horas

8. RNA: preparação
• Isolamento:
• Rneasy Kit (Quiagen)
• Remoção de DNA:
• Dnase I
• Análise de integridade:
• Agilent bioanalyzer (Agilent technologies)
• Remoção de rRNA:
• Ribo-zero rRNA removal kit
• Construção da biblioteca e sequenciamento:
• TruSeq RNA sample preparation v2 (illumina)

9. Análise dos dados de RNA-Seq
• Qualidade:
• FASTQC
• Anotação:
• RefSeq e PATRIC
• Alinhamento:
• algoritmo BWA
• Quantificação de transcritos:
• BEDTools
• Normalização e expressão diferencial:
• DESeq

10. Análise dos dados de RNA-Seq
• Quantidade de reads para cada gene:
• Combinação dos dados de três réplicas biológicas
• Cálculo e ajuste dos P-values:
• FDR (False Discovery Rate)
• Classificação funcional dos genes projetada a partir do
genoma da M. catarrhalis RH4:
• Identificação das proteínas ortólogas entre diferentes cepas
usando o melhor blast hit recíproco

11. Análise estatística
• Desvio padrão médio: ± 1
• Diferenças entre grupos:
• Análise de variância one-way com correção de Bonferroni
(software Prism 5.01)
• P < 0,05 foi considerado como significante estatisticamente

12. Genes diferencialmente expressos envolvidos em:
• Transcrição e replicação
• Metabolismo de lipídio
• Biossíntese do envelope proteico
• Metabolismo de nitrogênio
• Aquisição de ferro
• Metabolismo de fosfato
• Metabolismo de enxofre
• Stress oxidativo
• Metabolismo de nucleotídeos
RESULTADOS E DISCUSSÃO

13. Sequenciamento da M. catarrhalis
após exposição a 26oC e 37oC
• RNA-Seq foi executado para 3 réplicas biológicas
• Crescimento em diferentes temperaturas
utilizando Illumina HiSeq 2000 system.

14. Sequenciamento da M. catarrhalis
após exposição a 26oC e 37oC
• Total de reads
• = 183 milhões
• Total de reads de mapeamento único
• = 47.900.062
• Reads alinhados com regiões de non-rRNA para cada
amostra
• = 3,2-14,5 milhões (25% do total de reads)

15. Sequenciamento da M. catarrhalis
após exposição a 26oC e 37oC
Reads de mRNA (% de
Amostra
Reads alinhados
Reads ≠ rRNA
todos os reads mapeados)
26°C_1
13.807.058
3.214.746
23%
26°C_2
27.880.294
9.966.862
36%
26°C_3
17.127.887
5.791.186
34%
37°C_1
19.038.969
5.038.161
26%
37°C_2
66.832.479
14.576.839
22%
37°C_3
38.898.117
12.527.014
32%

16. Sequenciamento da M. catarrhalis
após exposição a 26oC e 37oC
• Alta similaridade dos níveis de expressão de RNA entre as
duas condições
• R² > 0,97 e R² > 0,99, respectivamente
• 831 genes foram diferencialmente expressos de forma
significativa, maior que 1.5-fold a 26oC
• 429 genes regulados positivamente (RP)
• 402 genes regulados negativamente (RN)

17. Genes diferencialmente expressos
por função biológica

18. Validação por qRT-PCR

19. Transcrição e replicação
• Indução da expressão por choque frio:
• Vários genes (infB, rho, nusAB) envolvidos na modulação da
tradução foram induzidos por choque frio.
• Fatores de transcrição (dksA, rho, nusA/B, nadR)
• DNA-depent RNA polymerases (rpoA, rpoC)
• Genes envolvidos na replicação de DNA, Recombinação e
reparo (dnaA/E, recN/G, topA)

20. Metabolismo de energia e
carbono
• Maior expressão a 37oC:
•
•
•
•
Enzimas glicolíticas (fbp, gapA, gpmI, eno, ppsA, aceE)
D-lactase dehydrogenase (dld)
L-lactase dehydrogenase (lldD)
Acetate kinase, necessário para conversão de acetato em acetylCoA
• Malic enzyme, que converte malato em piruvirato
• Regulados positivamente a 26oC:
• Triose-phosphate isomerase (tpiA), catalisadora da conversão
reversível de glyceraldehyde-3-phosphate e dihydroxyacetone
• Glucose-6-phosphate isomerase (pgi)

21. Metabolismo de energia e
carbono
• Regulados positivamente a 26oC:
• Enzimas do ciclo de Krebs
• Genes codificantes de succinate dehydrogenase (sdhA), aconitate
hydratase (acnB) e enzima do glyoxylate bypass (aceB)
• Necessários para glucogênese

22. Metabolismo de Lipídeos
• Indução a 26oC:
• Genes codificantes de enzimas envolvidas na degradação de
ácidos graxos (fadJ, fadD/fadK, pgpA)
• Expressão reduzida a 26oC:
• Genes envolvidos na codificação de enzimas ou reguladores da
biossíntese de ácidos graxos (fabB, fabH, accABCD)
• Indução após a exposição a 37oC:
• ompE, putative Fadl homolog e long-chain-fatty-acid transporter

23. Biossíntese do envoltório
celular
• Os níveis de expressão de vários genes envolvidos na
biossíntese de LOS (lpxB, lpxX, kdtA e lgt6) foi elevado por
choque frio.
• A expressão de genes codificadores de LpxB e LpxL
acytransferases foram elevados a 37oC (incorporação de
cadeias secundárias de acyl em lipídeo A)
• No entanto, verificou-se que 26oC pode não ser
suficientemente baixo para induzir mudanças notáveis na
estrutura LOS ou a ação recíproca da LpxB e LpxL
acytransferases podem compensar esse efeito

24. Metabolismo de nitrogênio
• Genes induzidos por choque frio:
• Genes da via de desnitrificação (transformação de nitratos e
outras substâncias em gás nitrogênio):
• Nitrite reductase (aniA), Nitric oxide reductase (norB), Nitrate ABC
transporter complex (nrtABCD)
• Gene repressor nsrR, indicando uma forma de prevenir a superexpressão descontrolada dos genes da via de desnitrificação
• Glutamine synthetase (glnA), envolvida na assimilação de
nitrogênio

25. Aquisição de ferro
• Regulação positiva em 26oC:
• Genes codificadores de proteínas de ligação de transferrina
(tbpA/B) e lactoferrina (lbpA/B)
• afeBCD gene cluster, envolvido na aquisição de ferro quelado
• Regulação negativa em 26oC:
• Bacterioferritins A/B (bfrA/B) envolvida no armazenamento
intracelular de ferro (5.5 e 6.2-fold)

26. Metabolismo de fosfato
• Os níveis de expressão de genes envolvidos no transporte de
fosfato e utilização tiveram um aumento significativo a 26oC
em comparação com 37oC. Exemplo:
• PstS -> Phosphate ABC transporter periplasmic phosphatebinding protein (110-fold)
• PstC -> Phosphate transport system permease protein (63-fold)

27. Metabolismo de enxofre
• A transcrição dos genes envolvidos na via de assimilação de
enxofre (cys DHNI) foi regulada positivamente depois da
exposição ao choque frio.
• Via essencial para sobrevivência e expressão da virulência em
muitas bactérias patógenas.

28. Stress oxidativo
• Expressão gênica elevada a 37oC:
• Genes envolvidos na resposta ao stress oxidativo:
superoxide dismutase A (sodA), catalase (katA), alkyl
hydroperoxide reductase (ahpC/F), etc.
• Indica tolerância ao stress oxidativo a 37oC

29. Metabolismo de nucleotídeos
• Nucleotídeos são importantes substratos para síntese e
reparo de DNA
• A exposição a 37oC induz a expressão de genes
associados ao metabolismo de nucleotídeos
• Maioria dos genes envolvidos na biossíntese de purina
(purCHMN, guaB, prsA) e pirimidina (pyrBDE, carA)

30. Considerações Finais
• É concebível que o choque frio promova a virulência da M.
catarrhalis
• Por exemplo:
• Ativa a expressão do gene uspA1, que aumenta a aderência da
bactéria nas células epiteliais da faringe
• Diversas vias metabólicas associadas à resposta ao stress são
ativadas
• Indução de um complexo de mecanismos adaptativos

31. OBRIGADO!