Bacteriologia - Fundamentos
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O documento descreve fundamentos da microbiologia como microscopia, coloração de Gram e Ziehl-Neelsen, morfologia bacteriana e estruturas celulares. Ele discute partes do microscópio, aumentos, resolução, tamanhos de microrganismos, paredes celulares, corantes, colorações e formas bacterianas como cocos, bacilos, espirilos e suas estruturas como cápsula, flagelo e plasmídios.
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- 1. BACTERIOLOGIA Goiânia 2014 Prof. Me. Farm. Rodrigo Caixeta Faculdade Unida de Campinas Curso de Farmácia
- 4. RESPOSTAS: 1) Oculares 7) Base 2) Canhão 8) Fonte de Luz 3) Objetiva 9) M(i/a)crométrico 4) Mesa 10) Pinça e Charriot 5) Condensador 11) Plug da Fonte 6) Diafragma 12) Braço 13) Revólver
- 5. FUNDAMENTOS DA MICROSCOPIA F – Ponto Focal f – Distância Focal Olho Humano 25 cm ou 10 pol Potencial de Amplitude
- 7. Ex1. Uma espécime é observada ao microscópio de luz (campo claro) em uma lente objetiva de 40X e a ocular do microscópio é 10X. a) Qual é a amplitude da imagem observada? b) Qual é o tamanho real de um microrganismo observado, com medida de 0,002 cm? A amplitude revela a magnitude da imagem virtual Amplitude = Ocular x Objetiva Ocular: 10X Temos que: A = 40 x 10 Objetiva: 40X Então.... A = 400X Com a amplitude, é possível revelar o tamanho do microrganismo Temos, a partir do item (a) que: A = 400X Então a imagem real foi ampliada em 400 vezes. Se na imagem virtual a régua mede 0,2 cm, o tamanho real é 400 vezes menor, ou seja, 0,002 400 = 0,0005 cm
- 8. 0,0005 cm 5,0 x 10-4 cm 5 mm MICRORGANISMO TAMANHO MÉDIO VÍRUS 0,05 mm – 0,9 mm BACTÉRIAS 0,3 mm – 2,0 mm FUNGOS 2,0 mm – 10 mm 10-2
- 12. RESOLUÇÃO
- 14. FUNDAMENTOS DA MICROSCOPIA ÍNDICE DE REFRAÇÃO (n): É a variação da velocidade da luz em diferentes meios. Ar Água 1 2 nágua > nar 𝑛 = 𝐶 𝑣
- 15. ESTRUTURAS BÁSICAS a) Membrana Plasmática b) Parede Celular c) Nucleóide d) Citoplasma e) Mesossomos f) Ribossomos g) DNA Cromossomal ESTRUTURAS ACESSÓRIAS a) Cápsula b) Flágelo c) Plasmídio d) Cílios e) Pili sexual ....
- 16. PREPARO DOS ESPÉCIMES FIXAÇÃO COLETA COLORAÇÃO - Pele, anexos e mucosas - Líquidos corporais e Secreções - Ambiente a) Por aquecimento e ar seco b) Reação química a) Exame Direto b) Diferencial c) Específica
- 18. FIXAÇÃO Pipeta Micrométrica Tubos para cultivo Solventes Orgânicos Placas de Petri e Meios de Cultura EPI e EPC Fonte de Calor Papel estraza Caneta marcadora Ponteiras
- 19. FIXAÇÃO • Etanol (Álcool 90-95%) • Ácido Acético • Mercúrio Clorado • Formaldeído (Formol 4%) • Glutaraldeído • Acetona
- 20. COMO PREPARAR UMA SOLUÇÃO? 1) Determinar soluto e solvente 2) Estabelecer condições de dissolução 3) Colocar aos poucos o soluto ao solvente 4) Agitar levemente até completa dissolução UNIDADES DE SOLUÇÃO Semelhante DISSOLVE Semelhante
- 21. FUNDAMENTOS DA COLORAÇÃO 1. Corantes Básicos (Catiônicos) Possuem grupos positivos e são geralmente vendidos na forma de sais de cloreto. CORANTES USUAIS Azul de Metileno Fucsina Básica Cristal Violeta Safranina Verde Malaquita
- 22. FUNDAMENTOS DA COLORAÇÃO 2. Corantes Ácidos (Aniônicos) Possuem grupamentos negativos, como carboxilas (-COOH) ou hidroxilas fenol (Ar-OH). CORANTES USUAIS Eosina Rosa Bengala Fucsina Ácida
- 23. EFEITO DO pH NOS CORANTES IÔNICOS
- 24. FUNDAMENTOS DA COLORAÇÃO 3. Corantes de Solubilização Ligam-se covalentemente e podem ser lipossolúveis ou hidrossolúveis seletivamente. CORANTES USUAIS Reagente de Schiff (PAS) Sudam III
- 25. COLORAÇÃO DE GRAM (1884)
- 27. A PAREDE CELULAR - Peptidoglicano NAM NAG Alanina Ácido Diaminopimélico Ácido Glutâmico
- 28. A PAREDE CELULAR GRAM+ • 20 – 80 nm • Homogênea Ácido Teicóico Ácido Lipoteicóico
- 30. A PAREDE CELULAR GRAM- • 2 – 7 nm • Heterogênea Lipoproteína de Braun LPS
- 34. COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN (1882) • Confeccionar o esfregaço seguindo as técnicas atuais de biossegurança; • Cobrir a lâmina com fucsina fenicada (o mordente é o ácido fénico); • Aquecer a lâmina até à emissão de vapores (é importante não deixar ferver); • Aguardar 5 a 8 minutos; • Lavar com água corrente; • Cobrir a lâmina com álcool-ácido 3% até descorar totalmente o esfregaço; • Lavar com água corrente; • Cobrir a lâmina com azul de metileno durante 1 minuto; • Lavar com água corrente; • Secar; • Observar.
- 38. A PAREDE CELULAR BAAR+ Arabinogalactana LAM Ácidos Micólicos
- 39. MORFOLOGIA BACTERIANA 1. Formas e Arranjos a) Cocos: Esféricas ou arredondada - Diplococos, Estreptococos, Estafilococos, Sarcina b) Bacilos ou bastão: Alongadas ou extensas - Cocobacilos, Bacilos curvos, Bastonetes c) Vibrios ou vibriões: Curvados em “vírgula” d) Micelares: Filamentoso e longo, multinucleados e) Espirilo e Espiroquetas: Espiraladas helicoidais f) Pleomórficas: letras chinesas, sem forma
- 40. FIGURA 1 COCOS - ESTREPTOCOCOS
- 41. FIGURA 2 BACILOS - CADEIA
- 42. FIGURA 3 ESPIRILOS - CÁPSULA
- 43. FIGURA 4 COCOS - ESTAFILOCOCOS
- 48. CÁPSULA • São importantes por: - Resistir à fagocitose - Depósito de nutrientes - Eliminação de Substâncias - Protege desidratação
- 49. FLAGELO
- 50. FLAGELO
- 51. PLASMÍDIOS • Plasmídios Conjuntivos • Plasmídios Não-Conjuntivos • Plasmídeo F • Plasmídeo R • Degradativos • Virulência
- 52. ESPOROS
- 54. ALGINATO • Formação de Biofilmes Ácido Algínico - É uma associação simbiótica - Altamente Resistente - Comunicação - Harmônico Pseudomonas aeruginosa
Notas do Editor
- Campo Claro, Campo Escuro, Contraste de Fase e Fluorescência.
- A microscopia opera a partir dos raios de luz que passam pelas lentes. Assim, o desvio da luz (refração) entre dois meios distintos em relação ao foco da imagem real é importante na formação das imagens. O olho humano consegue focar um objeto quando afastado 25 cm ou 10 polegadas do olho do observador. O Ponto focal (F) é a localização exata em que o objeto emite ou reflete a luz e a distância focal é a posição desse objeto em relação ao observador. Sendo esta última, responsável pelo potencial de amplitude (o quanto a imagem real é ampliada) a que o microscópio possui.
- Existe uma variedade de microscópios: campo claro, campo escuro, fase de contraste e fluorescência. Um microbiologista utiliza aquele que melhor tiver potencial de amplitude para o microrganismo estudado. No caso do microscópio de campo claro, a imagem virtual é formada no fundo do braço (dentro) do microscópio, ou seja, um pouco à mais que os 25 cm de amplitude focal do olho humano. As lentes da objetivas que magnificam essa amplitude.
- Propriedade Multiplicativa das Potências de mesma base: “Conserva-se a base e somam os expoentes”
- O microscópio de campo claro forma uma imagem escura em um fundo claro.
- Exemplos de imagens virtuais em microscópios diferentes do de campo claro. Da esquerda para direita, de cima para baixo: Bactérias em campo escuro, Fungos em campo escuro, Protozoário em contraste de fase e Bactérias em fluorescência.
- A parte mais importante em um microscópio são as objetivas. Não pela magnificação do tamanho da imagem real, mas pela produção de uma imagem limpa que aproxima-se das estruturas e detalhes da imagem real – o que chamamos de RESOLUÇÃO. Em uma definição mais ampla, resolução é a habilidade das lentes para separar ou distinguir objetos pequenos muito próximos. A equação de Abbé relaciona a resolução: (λ) é o comprimento de onda da luz emitida pela fonte e (n sen θ) é a abertura numérica. A equação anterior indica que um fator importante na resolução é o comprimento de onda da luz utilizada. O comprimento de onda deve ser mais curto do que a distância entre dois objetos, ou não serão vistos claramente. Deste modo, a maior resolução é obtida com luz o menor comprimento de onda, a luz na extremidade azul do espectro visível (na gama de 450-500 nm).
- A microscopia eletrônica possui faixa de resolução maior que o microscópio óptico.
- Para melhorar a resolução quando a objetiva número de abertura menor (100x) tem-se duas alternativas: usa-se o óleo de imersão, ocorrendo o efeito da refração ou concentram-se os raios de luz com o condensador.
- Na equação do índice de refração (n), tem-se: (C) como a velocidade da luz [3 x 108 m/s] e (v) como a velocidade do raio incidente. O raio incidente desvia o ângulo para mais agudo quando o índice de refração do meio incidente é maior que o meio de origem. O oposto também ocorre.
- A membrana plasmática diferencia das células eucarióticas pela quantidade de proteínas ser maior nas células procarióticas e por não apresentar colesterol na composição (hopanóides). É um local crucial para os processos metabólicos bacterianos como: respiração, fotossíntese, síntese de lipídeos e constituintes da parede celular e provavelmente a segregação cromossomal. Os mesossomos são invaginações da MP em forma de vesículas, túbulos ou lamelas. É frequente em bactérias GRAM+ e provavelmente, carreiam enzimas importantes para o metabolismo de membrana. Quanto ao nucleóide, onde há o armazenamento do DNA, algumas bactérias apresentam um DNA fita dupla e outros linear.
- Coleta: É o processo que se colhe espécimes a partir de um material específico para o estudo. Fixação: É o processo cujas estruturas externas e internas dos microrganismos são preservadas e fixadas em uma posição da lâmina. Existe componentes que inativam enzimas e o metabolismo microbiano. A) Processo físico que preserva a morfologia externa e B) Processo químico (a substância reage com o componente celular) que preserva estruturas e subestruturas dos microrganismos. Coloração: É o processo químico que evidencia estruturas a partir de grupamentos cromóforos (porções de cor) conjugadas à um corante. Os tipos de ligação que ocorrem são: iônicas, covalentes ou hidrofóbica. A) Ao microscópio de luz a espécie não é corada e sim, descorada. A emissão de luz evidencia sombra e penumbra que sugere uma morfologia. B) Na coloração de GRAM, diferentes corantes (básicos ou ácidos) impregnam na parede celular bacteriana e revelam diferentes colorações para as estruturas básicas dos microrganismos. A coloração de BAAR é específica para alguns gêneros bacterianos. C) O contraste entre colorações do fundo e corantes específicos impregnados no microrganismo evidenciam estruturas acessórias.
- Da esquerda para direita, de cima para baixo: 1- Coleta do Material no Paciente, 2- Conservação para encaminhar ao laboratório, 3- Semeação (isolamento), 4- Realização de testes em microplacas, 5- Realização de Microscopia (caracterização), 5- Análise de Cultura, 6- Distribuição da Cultura, 7-Protocolação e Análise Final (CQ) e 8-Escrituração dos resultados.
- EPI’s e EPC’s; Placas de Petri; béquer, Tubos de Vidro, Bico de Bunsen, Alça de repique, Papel.
- Corantes básicos possuem uma forma pentavalente de nitrogênio e frequentemente são usados em bacteriologia, enquanto corantes ácidos em micologia.
- Corantes básicos quanto corantes ácidos são usados para determinar tamanho, forma e arranjo morfológico.
- A polaridade do aminoácido ou da proteína altera de acordo com o pH do meio em que se encontra. Portanto, corantes iônicos devem ter um controle de pH quando utilizados.
- O Reagente de Schiff é composto por ácidos que atacam covalentemente açúcares (resíduos de glicose e riboses) do DNA, produzindo aldeídos e revelando uma coloração púrpura-magenta. É muito utilizado para classificar histoplasmose e dermatomicoses. O Sudam III cora seletivamente lipídeos, principalmente triglicerídeos e lipoproteínas.
- O GRAM é um procedimento de coloração diferencial. Cristal violeta e Violeta de Genciana (básicos - catiônicos) são sinônimos e participa da coloração primária da coloração de GRAM. O Lugol (solução aquosa de iodo) é a solução mordente que possui a função de aumentar a interação entre a célula e o corante. A solução mordente confere resistência do espécime às lavagens e exposição ao sol e mantém a durabilidade da cor. A descoloração é a etapa principal e determinante da diferenciação. A contracoração é a etapa de recoloração com corante ácido (aniônico).
- GRAM+ se coram de roxo ao violeta. GRAM- se coram de rósea ao vermelho. A parede celular bacteriana é uma estrutura comum às células procarióticas que determina a forma da bactéria. Serve de proteção e pode conter substâncias tóxicas ao hospedeiro ou agressor (p. ex., LPS) e é o sítio de ação de muitos antibióticos. A classificação bacteriana quanto à coloração de GRAM determina diferentes componentes químicos na parede de diferentes bactérias. Trata-se de um método qualitativo de baixa sensibilidade e alta especificidade. Os componentes da parede só podem ser evidenciados através da microscopia eletrônica.
- Peptidoglicano ou Mureína são sinônimos. A presença de D-aminoácidos (Alanina e Ác. Glutâmico) protegem a bactéria das ações de peptidases. Esses aminoácidos conectam ao grupamento carboxílico do NAM. A substituição da ordem desses aminoácidos constituem um mecanismo de resistência bacteriana. A ponte de pentaglicina (alternativa da ligação carboxi-terminal da d-glicina e amino-terminal do ácido diaminopimélico) é um componente de rigidez para a parede celular. Algumas bactérias GRAM- não possuem essa ponte. A parede celular bacteriana é uma estrutura comum às células procarióticas que determina a forma da bactéria. Serve de proteção e pode conter substâncias tóxicas ao hospedeiro ou agressor (p. ex., LPS) e é o sítio de ação de muitos antibióticos. A classificação bacteriana quanto à coloração de GRAM determina diferentes componentes químicos na parede de diferentes bactérias. Trata-se de um método qualitativo de baixa sensibilidade e alta especificidade. Os componentes da parede só podem ser evidenciados através da microscopia eletrônica.
- Envelope é o nome dado ao conjunto: membrana plasmática, parede celular e capsula, quando houver. Os ácidos teicóicos são polímeros de glicerol e ribitol unidos por grupos fosfatos, negativamente polarizados, o que explica ligar-se fortemente ao corante Cristal Violeta. Não possuem funções esclarecidas.
- Esquemas da Parede celular GRAM+ e estrutura química dos ácidos teicóicos.
- As GRAM- possuem uma delgada parede celular e heterogênea. A membrana plasmática está inteiramente em contato com a membrana externa (outer) e constituem juntas um sítio de adesão e comunicação intraplasmática. Na maioria das bactérias, a membrana externa possui LPS (lipopolissacarideo) que é uma endotoxina e epítopo antigênico. Ela possui 3 regiões: o lipídeo A (2 derivados de glucosamina, ácidos graxos e fosfato), o core polissacarídico (resíduos de 10 açúcares) e o antígeno O (local de ligação com o anticorpo). O peptidoglicano corresponde à menos que 5% ou 10% do peso seco da bactéria.
- A lipoproteína de Braun é a proteína mais abundante na parede celular.
- Efeitos comuns de infecções por bactérias G-
- Exemplos de espécies G+ e G-
- É uma técnica utilizada para corar bactérias dos gêneros: Mycobacterium e Nocardia spp. São bactérias altamente resistentes à coloração devido elevado teor de lipídeos estruturais na parede celular destas bactérias, que provoca uma grande hidrofobicidade, dificultando a ação de soluções mordentes e diferenciadores de corantes aquosos.
- BAAR+/-
- BAAR+/-
- Esta parede celular é responsável por muitas das propriedades caracterísitcas da bactéria (p. ex., acidorresistência, crescimento lento, resistência a detergentes, resistência aos antibióticos antibacterianos comuns, antigenicidade, aglutinação). A estrutura básica da parede celular é típica da parede das bactérias Gram positivas: uma membrana plasmática interna recoberta por uma camada espessa de peptidioglicano e ausência de membrana externa. No entanto, a estrutura da parede celular nas micobactérias é muito mais complexa do que em outras bactérias Gram positivas. Ancorados à parede celular estão proteínas, manosídios de fosfatidilinositol e lipoarabinomanana (LAM). O LAM é funcionalmente relacionado aos lipopolissacarídios antigênicos O, presentes em outras bactérias.
- A coloração negativa com Tinta Nanquim (Tinta da China) é o método de coloração mais utilizado para cápsula. Neisseria gonorrhoeae é uma bactéria diplococos que NÃO apresenta cápsula. Diferente do Streptococcus pneumoniae (lanceolada).
- A coloração utilizada é o método de Leifson (com Para-rosalina) ou Gray (Fucsina Básica). Possui duas funções: Locomoção e Taxonomia.
- A-Monótricas; B-Lofótricas; C-Anfítricas; D-Perítricas;
- Os plasmídeos são ferramentas importantes nos laboratórios de genética e bioquímica, onde são usados rotineiramente para multiplicar genes específicos. Há muitos plasmídeos com esse fim disponíveis no mercado. Inicialmente, o gene a ser replicado é inserido num plasmídeo. Este plasmídeo deverá conter, além do gene inserido, um ou mais genes capazes de conferir resistência antibiótica à bactéria que servir de hospedeiro. Os plasmídeos são então inseridos em bactérias por um processo chamado "transformação", e estas são depois incubadas em meio de culturasuplementado com antibiótico(s) específico(s). As bactérias que contiverem então uma ou mais cópias do plasmídeo expressam (fazem proteínas a partir de) o gene que confere resistência aos antibióticos. Tipicamente, a célula produz uma proteína que destrói os antibióticos que, de outra forma, matariam a célula. Os antibióticos matam ou inibem a divisão das células que não receberam plasmídeo, porque não possuem os genes de resistência aos antibióticos. O resultado é que só as bactérias com a resistência aos antibióticos sobrevivem, e estas são as mesmas que contém o gene a ser replicado. Desta forma, os antibióticos actuam como filtros que seleccionam apenas as bactérias modificadas. Estas bactérias podem ser posteriormente cultivadas em grandes quantidades, recolhidas e destruídas para isolar o plasmídeo de interesse. Outro uso importante dos plasmídeos é na produção de grandes quantidades de proteínas. Neste caso, cultivam-se as bactérias que contêm um plasmídeo que inclui o gene que codifica a proteína pretendida. Da mesma forma que uma bactéria produz proteínas que lhe conferem resistência aos antibióticos, também pode ser induzida a produzir grandes quantidades de proteínas a partir do gene que nelas foi introduzido. Esta é uma maneira de baixo custo e simples de produzir um gene ou a proteína que ele codifica - por exemplo, a insulina - ou até mesmo antibióticos.
- O esporo é uma camada que protege a bactéria e é responsável pela resistência e ao ataque dos agentes fisicos e químicos da esterilização e desinfecção. Ocorre bastante com anaeróbios estritos, como os gêneros Bacillus e Clostridium spp. A coloração para esporo é chamada de Schaeffer-Fulton (com verde malaquita).
- Principal causa de resistência microbiana em ambiente hospitalar.