Métodos Estudo Biologia Celular

CitologiaCitologia
MÉTODOS DE ESTUDO EMMÉTODOS DE ESTUDO EM
BIOLOGIA CELULARBIOLOGIA CELULAR
(aula 1)(aula 1)

 MORFOLOGIA, ESTRUTURA, FISIOLOGIAMORFOLOGIA, ESTRUTURA, FISIOLOGIA
 TECNOLOGIA DA BIOLOGIA CELULARTECNOLOGIA DA BIOLOGIA CELULAR
 Microscopia ópticaMicroscopia óptica
 Técnicas citoquímicasTécnicas citoquímicas
 Microscopia eletrônicaMicroscopia eletrônica
 Métodos de isolamento de organelasMétodos de isolamento de organelas
 Métodos de isolamento celularMétodos de isolamento celular
 Cultura celularCultura celular in vitroin vitro
 Métodos de isolamento de moléculasMétodos de isolamento de moléculas
 Manipulação genéticaManipulação genética
⇒⇒ Biologia Celular e MolecularBiologia Celular e Molecular
MÉTODOS DE ESTUDO EMMÉTODOS DE ESTUDO EM
BIOLOGIA CELULARBIOLOGIA CELULAR

 MODELOS CELULARESMODELOS CELULARES
 Escherichia coliEscherichia coli
Célula bacteriana mais avaliada e conhecida emCélula bacteriana mais avaliada e conhecida em
todo o mundo.todo o mundo.
 Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
Célula leveduriforme, mais utilizada em estudosCélula leveduriforme, mais utilizada em estudos
de eucariontes unicelulares.de eucariontes unicelulares.
ESTUDO DE CÉLULASESTUDO DE CÉLULAS

 EXAMES DE TECIDOS À FRESCOEXAMES DE TECIDOS À FRESCO
 EXAMES DE TECIDOS MORTOS E PRESERVADOSEXAMES DE TECIDOS MORTOS E PRESERVADOS
 PROBLEMAS:PROBLEMAS:
 Células translúcidasCélulas translúcidas
 Células pequenas e complexasCélulas pequenas e complexas
 VISUALIZAÇÃO:VISUALIZAÇÃO: - Coloração- Coloração
ESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIAESTUDO CELULAR EM MICROSCOPIA

 COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICOCOLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO
 Montagem totalMontagem total
Fino ou transparente para ser posto em lâmina.Fino ou transparente para ser posto em lâmina.

 EsfregaçoEsfregaço
Fluidos corpóreos são postos em lâmina e éFluidos corpóreos são postos em lâmina e é
feito um deslizamento do material.feito um deslizamento do material.

 EspalhamentoEspalhamento
Raspagem de mucosas; o material é deslizadoRaspagem de mucosas; o material é deslizado
em lâmina.em lâmina.

 EsmagamentoEsmagamento
Esmaga-se o material com lamínula. Útil paraEsmaga-se o material com lamínula. Útil para
estudo de divisão celular e núcleos interfásicos.estudo de divisão celular e núcleos interfásicos.

 DecalqueDecalque
Fragmentos de órgãos moles são pressionadosFragmentos de órgãos moles são pressionados
contra a lâmina; os núcleos celulares ficamcontra a lâmina; os núcleos celulares ficam
impressos na lâmina.impressos na lâmina.

 Corte histológicoCorte histológico
São feitos corte extremamente finos de tecidoSão feitos corte extremamente finos de tecido
para fixação em lâmina.para fixação em lâmina.

 FIXAÇÃO DE TECIDOSFIXAÇÃO DE TECIDOS
 Formol, Glutaraldeído, Misturas fixadoras...Formol, Glutaraldeído, Misturas fixadoras...
 PREPARAÇÃO DE CORTES HISTOLÓGICOSPREPARAÇÃO DE CORTES HISTOLÓGICOS
 Cortes de tecidoCortes de tecido
 DesidrataçãoDesidratação
 DiafanizaçãoDiafanização
 Infiltração / impregnaçãoInfiltração / impregnação
 Cortes emCortes em µµmm
 ColoraçãoColoração
 MontagemMontagem
 VisualizaçãoVisualização

DesidrataçãoDesidratação DiafanizaçãoDiafanização InfiltraçãoInfiltração
MicrotomiaMicrotomiaColoraçãoColoraçãoMontagemMontagem
FixaçãoFixação

InfiltraçãoInfiltraçãoFixaçãoFixação
Química:Química: - Aldeídos- Aldeídos
- Mercuriais- Mercuriais
- Alcoólicos- Alcoólicos
Física:Física: - Congelamento e dessecação- Congelamento e dessecação
- Calor- Calor
- Ar seco- Ar seco
ParafinaParafina
MetacrilatosMetacrilatos
GelatinasGelatinas
Resinas plásticasResinas plásticas
etc...etc...

ColoraçõesColorações
SIMPLES:SIMPLES:
- Corantes Básicos- Corantes Básicos
HHematoxilina (roxo)
Azul de toluidina e Guinsa
Azul de metileno
- Corantes Ácidos
Eosina (rosa)
Orange G
Fucsina ácida

ESPECIAIS:ESPECIAIS:
- Citoquímica / Histoquímica:Citoquímica / Histoquímica: IIdentificação de moléculas nas
células
 PAS (Periodic acid Schiff): identifica GLICOGÊNIO e
GLICOPROTEÌNAS
Reação com PAS:
reações de oxidação e coloração

- Citoquímica / Histoquímica: Identificação de moléculas nas
células
 Feulgen: identifica DNA

células
 Substratos de Enzimas: identifica atividade de ENZIMAS.
Reação com Fosfatase Ácida
Reação com Fosfatase Alcalina

células
 Sudan Black, Sudan III, Azul de Nilo: identifica LIPÌDEOS.
Coloração com Sudan Black e Sudan III

células
 Ribonuclease: identifica RNA;
 Formaldeído: identifica CATECOLAMINAS;
 Técnicas variadas: identificam AMINOÁCIDOS
Técnica de Millon – tirosina
Técnica do diaminoazobenzeno – triptofano
Técnica de Sakaguchi - arginina

- Imunocitoquímica / Imunohistoquímica: Identificação de
moléculas específicas nas células, excluindo todas as outras;
- Baseia-se na reação antígeno-anticorpo.
 MÉTODO DIRETO: utiliza um anticorpo marcado;
- Peroxidase
- Corantes fluorescentes
- Ferritina
- Ouro coloidal + Proteína A
 MÉTODO INDIRETO: utiliza uma antigamaglobulina marcada.

MÉTODO DIRETO: utiliza um anticorpo marcado;

MÉTODO INDIRETO: utiliza uma antigamaglobulina marcada;

Imunohistoquímica Imunofluorescência

RADIOAUTOGRAFIARADIOAUTOGRAFIA
 Determina o local de síntese de macromoléculas e seusDetermina o local de síntese de macromoléculas e seus
destinos na célula.destinos na célula.

Síntese de RNASíntese de RNA Marcação de DNAMarcação de DNA
RADIOAUTOGRAFIARADIOAUTOGRAFIA

 CENTRIFUGAÇÃOCENTRIFUGAÇÃO
 Permite isolar organelas de homogeneizados celulares,Permite isolar organelas de homogeneizados celulares,
para análises químicas, físicas e biológicas;para análises químicas, físicas e biológicas;
 O isolamento de uma organela depende de:O isolamento de uma organela depende de:
- seu coeficiente de sedimentação;- seu coeficiente de sedimentação;
- densidade e viscosidade da solução.- densidade e viscosidade da solução.
 Centrifugação Fracionada;Centrifugação Fracionada;
 Centrifugação Contra Gradiente.Centrifugação Contra Gradiente.
SEPARAÇÃO DESEPARAÇÃO DE ORGANELASORGANELAS CELULARESCELULARES

Centrifugação FracionadaCentrifugação Fracionada

Centrifugação Contra GradienteCentrifugação Contra Gradiente
 CENTRIFUGAÇÃOCENTRIFUGAÇÃO
SEPARAÇÃO DESEPARAÇÃO DE ORGANELASORGANELAS CELULARESCELULARES

 FACSFACS
 Permite isolar célulasPermite isolar células
marcadas por anticorpomarcadas por anticorpo
fluorescente.fluorescente.
SEPARAÇÃO DESEPARAÇÃO DE CÉLULASCÉLULAS

 Três tipos de céulas animais podem ser cultivadas noTrês tipos de céulas animais podem ser cultivadas no
laboratório:laboratório:
 Linhagens celulares primáriasLinhagens celulares primárias
- crescem e se dividem por um número finito de- crescem e se dividem por um número finito de
gerações celulares.gerações celulares.
 Linhagens celulares imortalizadasLinhagens celulares imortalizadas
- derivadas de linhagens primárias, mas têm- derivadas de linhagens primárias, mas têm
capacidade de se dividir indefinidamente.capacidade de se dividir indefinidamente.
 CélulasCélulas CancerosasCancerosas
- mostram propriedades características de câncer e- mostram propriedades características de câncer e
são também imortais.são também imortais.
CULTURA DECULTURA DE CÉLULASCÉLULAS

Células em cultura.
(A) Fibroblastos em cultura.
(B) Mioblastos se fundindo para formar as
células musculares multinucleadas.
(C) Oligodendrócito – célula precursora
(D) Células imortalizadas de tabaco

 APLICAÇÕES:APLICAÇÕES:
 Cultivo de órgãos embrionários;Cultivo de órgãos embrionários;
 Produção de vegetais a partir de células totipotentes;Produção de vegetais a partir de células totipotentes;
 Estudo do metabolismo de células tumorais;Estudo do metabolismo de células tumorais;
 Estudo das interações célula-célula;Estudo das interações célula-célula;
 Estudo das relações entre células e vírus;Estudo das relações entre células e vírus;
 Pesquisas citogenéticas (diagnóstico de doenças causadasPesquisas citogenéticas (diagnóstico de doenças causadas
por anomalias cromossomais);por anomalias cromossomais);
 Pesquisas sobre os requerimentos nutricionais das células.Pesquisas sobre os requerimentos nutricionais das células.

Mono-ocularMono-ocular BinocularBinocular Múltiplos observadoresMúltiplos observadores
MICROSCOPIAMICROSCOPIA
 MICROSCÓPIO ÓPTICO (OU MICROSCÓPIO DE LUZ)MICROSCÓPIO ÓPTICO (OU MICROSCÓPIO DE LUZ)

 MICROSCÓPIO ÓPTICO (OU MICROSCÓPIO DEMICROSCÓPIO ÓPTICO (OU MICROSCÓPIO DE
LUZ)LUZ)
 Microscópio de Polarização:Microscópio de Polarização:
Permite estudar aspectos sobre a organizaçãoPermite estudar aspectos sobre a organização
molecular da célula.molecular da célula.

 MICROSCÓPIO ÓPTICO (OU MICROSCÓPIO DEMICROSCÓPIO ÓPTICO (OU MICROSCÓPIO DE
LUZ)LUZ)
 Microscópio de Contraste de Fase e de ContrasteMicroscópio de Contraste de Fase e de Contraste
Interferencial :Interferencial :
Útil especialmente para o estudo de célulasÚtil especialmente para o estudo de células
vivas, cultivadas, sem uso de corantes.vivas, cultivadas, sem uso de corantes.Contraste de FaseContraste de Fase
Campo escuroCampo escuro
ComumComum
Contraste InterferencialContraste Interferencial

 Microscópio Confocal:Microscópio Confocal:
Oferece imagens de células que podem serOferece imagens de células que podem ser
combinadas para formar uma imagemcombinadas para formar uma imagem
tridimensional.tridimensional.

 Microscópio de Fluorescência:Microscópio de Fluorescência:
Promove a identificação de compostosPromove a identificação de compostos
naturalmente fluorescentes (clorofila, lignina,naturalmente fluorescentes (clorofila, lignina,
elastina, colágeno...) e identificação eelastina, colágeno...) e identificação e
localização de compostos que reagem comlocalização de compostos que reagem com
fluorocromos.fluorocromos.

ME de TransmissãoME de Transmissão ME de VarreduraME de Varredura
 MICROSCÓPIO ELETRÔNICOMICROSCÓPIO ELETRÔNICO

ME de TransmissãoME de Transmissão
 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃOMICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO
Um feixe de elétrons interage com o material,Um feixe de elétrons interage com o material,
atravessando-o para transmitir a imagem.atravessando-o para transmitir a imagem.

 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURAMICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA
Um feixe de elétrons bombardeia a superfície doUm feixe de elétrons bombardeia a superfície do
material “varrendo-a”; então, elétrons secundáriosmaterial “varrendo-a”; então, elétrons secundários
ou refletidos são utilizados para obter imagensou refletidos são utilizados para obter imagens
tridimensionais.tridimensionais.
ME de VarreduraME de Varredura

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