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Genética nos
Transtornos do Espectro Autista:
Pesquisa,
Aconselhamento genético e
diretrizes para o SUS
Maria Rita Passos-...
Coordenadora:
Mayana Zatz
Transferência de
Tecnologia:
Ma.Rita Passos-Bueno
Difusão, Educação:
Eliana Dessen
O Que fazemos?
 Aconselhamento Genético:
 Exames genéticos
 Orientação a risco de repetição
 Pesquisas em genética
 F...
Doenças do Espectro Autista
Epidemiologia
Prevalência mundial: ~1:150
4 meninos: 1 menina
Prevalência São Paulo: 2,72:1...
Autismo um “sinal clínico” de várias
Síndrome Genéticas
DOENÇA % autism % entre ASD
Síndrome do X Fragil 15%-30% 2%-5%
Esc...
Transtorno do Espectro Autista:
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< 20% ~80%
A maioria é caso único:
Genético?????
Transtorno do Espectro Autista:
É genético?
Herdabilidade
Alta: 50-90%
 Presente em síndromes genéticas bem definidas
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Doença heterogênea:
O que aprendemos nestes últimos 10 anos?
AUTISMO
Multifatorial
Alelos frequentes
Fatores geneticos +
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Transtorno do Espectro Autista:
Desde 2001
Interação social Comunicação
Comportamento repetitivo e
estereotipado
Colaboraç...
10 anos de experiência: 2001-2011
611 famílias avaliadas
 4 meninos : 1 menina
488 : 123
Herdabilidade: 78%
Risco de R...
Comorbidade:
244/611
TEA casos
 Epilepsia a alteração mais prevalente
 (~ 15% )
Proporção de casos da Síndrome
de X frágil entre os nossos
pacientes
Doença
Genética
Autismo % entre
TEA
(literatura)
% en...
Alterações Cromossômicas
3-5%
X Y
Alterações Cromossômicas
Análise Genômica
 Detecção de pequenas falhas ou material
genético a mais
 CNVs
(copy number variations)
O que é um CNV?
Nosso Genoma: E, se faltar uma peça?
Peça faltando = deleção
Peça sobrando = duplicação
Copy Number Variations
em Autismo (CNVs)
~10%
Maioria é específico de cada paciente
Uma alteração diferente para cada indivíduo
Exceções:
15q13 (<3%), 16p11 (<1%) e 22q13 (<1.4%)
+ de 1000 GENES “DE AUTISMO”
Pesquisa
Identificação de marcadores
moleculares para o diagnóstico do
Transtorno do Espectro Autista
Estabelecimento de c...
Análise de CNVS em
15q, 16p e 22q
531 indivíduos analisados:
11 CNVs
AUTISMO CNV + CNV - TOTAL
COM
EPILEPSIA
5 73 78
SEM
EPILEPSIA
6 447 453
TOTAL 11 520 P < 0.001
Pacientes com Autismo + Epi...
Medicina Atual
 Doses e seleção de remédios selecionados empiricamente
 Novos-velhos medicamentos
 Medicina personaliza...
Desafios em Autismo:
Como variantes genéticas causam o autismo?
Um indivíduo com autismo clássico e
com uma alteração genética
específica:
Deficiência de TRPC6
 ausência de fala
 Dific...
Controles (n=6) Paciente
Deficiência TRPC6 :
Causa alteração no funcionamento da célula?
Células tronca de polpa de dente
reprogramadas
iPSC
Induced pluripotent stem cells
Cells + transcription factors (cMYC, SO...
Diferenciação Neuronal
Neural progenitor
Cells (NPCs)
Neuronios
Dapi Lin28 Sox2 Merge
Dapi TRA-1-81 Nanog Merge
Dental Pulp DPSC iPSC +mEFs iPSC
A B C D
E
F
EndodermMesodermEctoderm
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Células Neuroprogenitoras:
Alteração do influxo de Cálcio
Neuronios: Vesículas Glutamatérgicas
Neurônios:
Diminuição de espinhas dendríticas
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P
P
P
P P P
P
P
P
P
P
Hiperforina
Controle Indivíduo com autismo
Principais conclusões
Deficiência de TRPC6 leva a alterações importantes da
celula nervosa do paciente com autismo.
TRPC...
Avaliação do citoesqueleto
Estudo da dinâmica do
citoesqueleto celular
Células tronco mesenquimais
iPSC-Neurônios
Biorepositório de células de
pacientes com TEA
Tipo celular Número
Células Mesenquimais 52
Células Pluripotentes 16
Genética e
o nosso Atendimento ao Autismo
 Levantamento da Genealogia
 Testes genéticos (X-fragil; MLPA para regiões
15q...
Por que fazer os
testes genéticos?
Síndrome do X Frágil
Importante para o
Aconselhamento Genético
NEGATIVO
<10%~50%
POSITIVO
Frágil X +
Testes Genômicos
Array CGH ou exoma: chance de dar
positivo ~10-15%
Dificuldades:
 Custo alto
 Dificuldades de interpr...
Testes genômicos:
Como podem ajudar?
Resultado
Negativo
Resultado
Positivo
Resultado
Positivo
Risco
recorrencia: Não MUDA ...
Importante avaliar todos os
membros da família
Risco recorrencia DIMINUI MUDA
Resultado
positivo
Resultado
positivo
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Genéticos/Aconselhamento
Genético
 Compreensão da etiologia
 Em alguns casos, é possível predizer risco de
epilepsia (me...
Quem Deve Pagar pelo
Teste Genético?
Quando e em quem fazer o teste?
Individuo com autismo: 3 anos
Pais jovens
Interesse em ter mais filhos
Indivíduo com autis...
Universidades e SUS
 Estabelecimento de parcerias:
 menor custo dos testes genéticos e com
controle de qualidade
 Estab...
Colaboradores atuais
FMUSP/Dr. Estevão Vasdaz
Elaine Zackai/Inst. Psicologia, USP
Andrea Sertié/ Inst. Pesquisa Einstei...
Obrigada
Células tronco mesenquimais de polpa
de dente
Análise de Transcriptoma
Autista x 6 não Autista
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  • Um aspecto muito relevante da epidemiologia do autismo é a razão sexual de afetados: há 4 homens afetados para cada mulher afetada. Este é um aspecto muito importante, pensando em termos de genética deste transtornos. Um outro dado relevante é a prevalência do transtorno, cuja as estimativas mais recentes são de 6:1000, ou 1:150. Uma discussão muito debatida atualmente é o aumento da prevalência/incidência do trasntorno nas últimas décadas. Isso estaria relacionado a uma causa ambiental? Porém, o que se tende a acreditar é que este aumento da prevalência/incidência se deve a uma maior disponibilidade de serviços, difusão do conceito (maior conhecimento sobre o assunto), mudanças no conceito diagnóstico – crianças antes identificadas como portadoras de retardo mental, são hj consideradas autistas
  • Frequent alleles with low effect, following a Multifactorial model of inheritance, have not been enough to explain the heritability of ASD. The genetic model has shifted to rare mutations in single genes (Monogenic disorders) or multiple-hits ( oligogenic models)
  • Dentre as doenças que atendemos: pacientes com doenças do espectro autista
  • Therefore, it is still a challenge in ASD to identify the causative mutations as it is unknown the genetic mechanism involved in a large proportion of case. Once a variant is identified, another relevant question is how is it is involved with the phenotype.
  • The chromosomal rearrangement in the other patient was more attractive, as it involved the exchange between chromosomes 3 and 11. The patient presents classical autism.
  • We would like to highlight that several genes important for neuronal cell adhesion and cytoskeletion were among the differentially expressed genes. Also, some several of these genes are known to be regulated by CREB, which is a transcription factor activated by TRPC6.

  • We therefore reprogrammed DPSC using 4 transcription factors
  • Using a standardized protocol, we were able to obtain neural progenitor cells as well as neuron, which were used for additional experiments.
    Para gerar as celulas progenitoras neurais, ou NPCs, nós cultivamos as iPS durante 1 semana em suspensão, na forma de corpos embrióides, ou Ebs, na presença de Noggin e na ausencia de FGF2. Apos esta 1 semana, nos plaquemos os Ebs e observamos a formaçao destas estruturas que se organizam radialmente, as rosetas. Após novamente, mais uma semana de cultivo, nós dissociamos estas rosetas, obtendo desta forma, as NPCs.
    Para gerar os neurônios, nós continuamos cultivando os EBs com ácido retinóico, e depois de 2 a 3 semanas, dissociamos os Ebs, obtendo os neurônios que foram fixados para as análises após novamente, cerca de 2 semanas
  • IPSC were positive for several markers of pluripotency. Injection of these cells subcutaneously lead to formation of teratomas showing that these cells have the potential to give rise to tissues of the three different germ layers, confiming their pluripotency.
  • First, we verified if calcium influx through TRPC6 was altered, after induction by hyperphorin. There is a decrease in calcium influx in patient’s cells as compared to control’s cells. ,Inicialmente, nós investigamos se nas NPCs a via do TRPC6 também estava alterada. Para isso nós medimos o influxo de calcio via este canal também estimulando estas células durante 30 min com hiperforina. Nós verificamos que o influxo de calcio via o TRPC6 está bastante diminuído nas células do paciente com relaçao as c;elulas do controle. Neste outro gráfico nós temos representado a intensidade média dos picos de máximos de Ca atingidos nestas celulas e nós vemos que o pico máximo de Ca no paciente está significativamente reduzido com relacao ao controle. Como existem evidencias que um outro canal da familia do TRPC6 tem papel na proliferacao das NPCs mediada por FGF, nós investigamos se o ciclo celular das NPCs estava alterado no pacoente e vimos que a porcentagem de células em G1, S ou G2 em um dado momento não difere entre o paciente e o controle, mostrando, portanto, que o TRPC6 não deve ter papel no controle do ciclo celular das NPCs.
  • Finally, we verified that the density of glutamatergic vesicles were reduce in cell’s patients, which was further confirmed in cells where TRPC6 were inactivated by ShTRPC6.
    Por fim, nós verificamos que a densidade de vesículas de glutamato nos neuronios deste paciente se encontra reduzida com relacao ao controle e, novamente, a transducao das celulas do controle com o shRNA contra o gene do TRPC6 tb leva a diminuicao da densidade destas vesiculas nos neurônios do controle, indicando novamente que o rompimento do TRPC6 é suficiente para responder pela alteracao fenotipica vista nos neuronios do paciente.
  • We also observed that the number of dendritic spines in these patient’s cells were decreased. This reduction in dendritic spines are possibly caused by deficiency of TRPC6, as similar results were observed in cells in which TRPC6 was inactivated by the use of ShTRPC6.
    Nós verificamos tb o número de espinhos dendríticos presentes nos neurônios destes indivíduos e vimos que no paciente, a densidade de espinhos dendríticos está reduzida com relaçao ao controle. Quando nós transduzimos as células do controle com um shRNA contra o TRPC6, nós verificamos que a densidade de espinhos dendriticos também diminui, mostrando portanto que a reducao de densidade de espinhos dendriticos no paciente se provavelmente se deve ao rompimento do TRPC6
  • Enfim, apenas para amarrarmos as principais conclusões do nosso trabalho, eu destaquei aqui alguns pontos:

    Primeiramente, embora o estudo da paciente portadora da translocação entre os cromossomos 2 e X não tenha sido conclusivo, nós fomos bem sucedidos em nosso objetivo no estudo do segundo caso, o da trabslocacao entre os crom 3 e 11, no qual nós identificamos o rompimento de um candidati funcional bastante relevante, o gene TRPC6. Nossos estudos revelaram que o rompimento do TRPC6 por si só leva a várias alterações funcionais nas células do paciente e dessa forma, este gene se torna mais um dos genes relacionados aos TEA. E os nossos resultados reforçam as evidências de que uma parcela considerável dos casos de autismo devem ser causadas por mutações em um único gene.

    Por fim, nossos resultados tb reforçam a hipótese de q os transtornos do espectro autista tenham várias causas genéticas distintas mas que resultam na alteracao de processos comuns. E alguns destes processos que podemos destacar são:

    A sinalização por Ca, que nós vimos que estava alterada no pacinete com rompimento do TRPC6 e como eu citei, mutaçoes patogenicas em varios genes envolvidos nesta via ja foram encontradas em pacientes autistas.

    Além de dados da literatura que apontam para o envolvimento de processos como dinamica de citoesqueleto e adesao celular na etiologia do autismo, nós encontramos evidênicas favorecendo esta hipótese tanto no estudo de expressão quanto no estudo do TRPC6.

    E por fim, como eu falei, além de dados no nível de seuqencia que favorecem a implicação da via do direcionamento axonal na etiologia do autismo, nossos dados de transcriptoma tb favorecem esta hipotese.

    E é possível então que estes diferentes processos estejam levando a alterações fenotípicas que podem ser comum aos pacinetes com autismo como p.e. alteração na formação de espinhos dendríticos e no sistema de neurotransmissao glutamatérgico, que como nós vimos são fenótipos comuns pelo menos ao paciente com rompimento do TRPC6 e pacientes com Rett.

  • O baixo grau de adaptabilidade dos indivíduos portadores em contraste com a sua alta freqüência na população são os aspectos fundamentais que norteiam a definição dos modelos de herança para os TEA. Até a década passada, acreditava-se que a maioria dos casos de autismo seguiam um modelo multifatorial ou poligênico de herança: o fenótipo seria resultado da combinação de diversas variantes alélicas de pequeno efeito somadas ou não a fatores ambientais. Isto explicaria a alta freqüência do transtorno, uma vez que variantes de pequeno efeito estão sujeitas a uma menor pressão seletiva e, dessa forma, podem se tornar freqüentes na população. No entanto, o número crescente de mutações patogênicas e de variações de número de cópias especialmente em genes de relevância funcional para o fenótipo que têm sido encontradas em pacientes autistas sugerem que, na verdade, uma parcela maior do que se previa dos casos deva ser explicada por modelos monogênicos, seja por herança diretamente de um alelo causador ou mutações de novo. Nesta situação, as variantes alélicas associadas a doença seriam de alto efeito e, portanto, mais raras na população. O que explicaria a alta freqüência dos TEA neste caso seria a existência de diferentes alterações individualmente raras em um mesmo gene (heterogeneidade alélica) ou em genes diferentes (heterogeneidade de locus), causando o mesmo fenótipo. Dessa forma, os TEA são considerados uma doença complexa, pois se acredita que possam se enquadrar em diferentes modelos de herança.
    Existem diversas estratégias que podem ser utilizadas na tentativa de se detectar as causas genéticas do autismo. Quando se pensa em modelos poligênicos, as estratégias mais utilizadas para se detectar variantes comuns são os estudos de ligação e de asociação. Para a busca de variantes raras, uma das estratégias são os estudos citogenéticos, que incluem tanto o estudo de anomalias detectadas por cariótipo quanto o estudo de CNVs. Eu destaco ainda os estudos de expressão e modelagem in vitro dos neurônios destes pacientes, utilizando a técnica de reprogramação celular. Estas abordagens podem ser utilizadas tanto para a investigação das consequencias moleculares de uma alteração genética específica, como foi utilizada no caso deste trabalho, quanto para identificacao de vias ou processos biológicos alterados nestes pacientes e neste caso, não é necessário que se estabeleça um modelo de herança a priori.
  • To address this question, we have initially compared the transcriptome of stem cells of the patient and 6 non ASD cells
  • Maria Rita Passos-Bueno - 30mai14 1º Congresso A&R SUS

    1. 1. 1
    2. 2. Genética nos Transtornos do Espectro Autista: Pesquisa, Aconselhamento genético e diretrizes para o SUS Maria Rita Passos-Bueno Instituto de Biociências,USP passos@ib.usp.br
    3. 3. Coordenadora: Mayana Zatz Transferência de Tecnologia: Ma.Rita Passos-Bueno Difusão, Educação: Eliana Dessen
    4. 4. O Que fazemos?  Aconselhamento Genético:  Exames genéticos  Orientação a risco de repetição  Pesquisas em genética  Formação de Recursos Humanos
    5. 5. Doenças do Espectro Autista Epidemiologia Prevalência mundial: ~1:150 4 meninos: 1 menina Prevalência São Paulo: 2,72:1000 • Paula et al 2011Rev Assoc Med Bras 57(1):2-5
    6. 6. Autismo um “sinal clínico” de várias Síndrome Genéticas DOENÇA % autism % entre ASD Síndrome do X Fragil 15%-30% 2%-5% Esclerose Tuberosa 25%-60% 1%-4% ASD com macrocefalia ND 1% Neurofibromatose 1 4% 0%-4% Síndrome de Rett 100% 2% Narayanan & Warren, 2006
    7. 7. Transtorno do Espectro Autista: ? < 20% ~80% A maioria é caso único: Genético?????
    8. 8. Transtorno do Espectro Autista: É genético? Herdabilidade Alta: 50-90%  Presente em síndromes genéticas bem definidas Schaefer et al., 2013, American College of Medical Genetics and Genomics
    9. 9. Doença heterogênea: O que aprendemos nestes últimos 10 anos? AUTISMO Multifatorial Alelos frequentes Fatores geneticos + ambientais Mutações em genes Específicos Alelos raros Multi-hit Mutação em mais de um gene Alelos raros Carter & Scherer, 2013; Schaefer et al., 2013,, Pinto et al., 2014
    10. 10. Transtorno do Espectro Autista: Desde 2001 Interação social Comunicação Comportamento repetitivo e estereotipado Colaboração FMUSP
    11. 11. 10 anos de experiência: 2001-2011 611 famílias avaliadas  4 meninos : 1 menina 488 : 123 Herdabilidade: 78% Risco de Recorrência: ~5% Moreira D, 2012, dissertação de mestrado
    12. 12. Comorbidade: 244/611 TEA casos  Epilepsia a alteração mais prevalente  (~ 15% )
    13. 13. Proporção de casos da Síndrome de X frágil entre os nossos pacientes Doença Genética Autismo % entre TEA (literatura) % entre TEA Brasileiros X Frágil 15%-30% 2%-5% 2.6% 2001-2014: 23/864 (2.6%)
    14. 14. Alterações Cromossômicas 3-5% X Y
    15. 15. Alterações Cromossômicas
    16. 16. Análise Genômica  Detecção de pequenas falhas ou material genético a mais  CNVs (copy number variations)
    17. 17. O que é um CNV? Nosso Genoma: E, se faltar uma peça? Peça faltando = deleção Peça sobrando = duplicação
    18. 18. Copy Number Variations em Autismo (CNVs) ~10% Maioria é específico de cada paciente
    19. 19. Uma alteração diferente para cada indivíduo Exceções: 15q13 (<3%), 16p11 (<1%) e 22q13 (<1.4%) + de 1000 GENES “DE AUTISMO”
    20. 20. Pesquisa Identificação de marcadores moleculares para o diagnóstico do Transtorno do Espectro Autista Estabelecimento de critérios para aumentar a chance de um teste molecular ser conclusivo
    21. 21. Análise de CNVS em 15q, 16p e 22q 531 indivíduos analisados: 11 CNVs
    22. 22. AUTISMO CNV + CNV - TOTAL COM EPILEPSIA 5 73 78 SEM EPILEPSIA 6 447 453 TOTAL 11 520 P < 0.001 Pacientes com Autismo + Epilepsia: 3 vezes maior chance do teste dar positivo Moreira et al., aceito hoje , Plos One
    23. 23. Medicina Atual  Doses e seleção de remédios selecionados empiricamente  Novos-velhos medicamentos  Medicina personalizada
    24. 24. Desafios em Autismo: Como variantes genéticas causam o autismo?
    25. 25. Um indivíduo com autismo clássico e com uma alteração genética específica: Deficiência de TRPC6  ausência de fala  Dificuldade de relacionamento  compartamento repetitivo Karina O. Griese Colaboration with Dr. State, Yale University Dr. Alysson Muotri, UCSD,U
    26. 26. Controles (n=6) Paciente Deficiência TRPC6 : Causa alteração no funcionamento da célula?
    27. 27. Células tronca de polpa de dente reprogramadas iPSC Induced pluripotent stem cells Cells + transcription factors (cMYC, SOX2, Nanog, OCT4) KARINA O. GRIESI/Dr. Muotri, UCSD, USA
    28. 28. Diferenciação Neuronal Neural progenitor Cells (NPCs) Neuronios
    29. 29. Dapi Lin28 Sox2 Merge Dapi TRA-1-81 Nanog Merge Dental Pulp DPSC iPSC +mEFs iPSC A B C D E F EndodermMesodermEctoderm iPSC Induced teratoma
    30. 30. Células Neuroprogenitoras: Alteração do influxo de Cálcio
    31. 31. Neuronios: Vesículas Glutamatérgicas
    32. 32. Neurônios: Diminuição de espinhas dendríticas
    33. 33. PP P P P P P P P P P P P Hiperforina Controle Indivíduo com autismo
    34. 34. Principais conclusões Deficiência de TRPC6 leva a alterações importantes da celula nervosa do paciente com autismo. TRPC6 é um novo candidato para o autismo IPSCs: triagem de drogas já conhecidas.
    35. 35. Avaliação do citoesqueleto Estudo da dinâmica do citoesqueleto celular Células tronco mesenquimais iPSC-Neurônios
    36. 36. Biorepositório de células de pacientes com TEA Tipo celular Número Células Mesenquimais 52 Células Pluripotentes 16
    37. 37. Genética e o nosso Atendimento ao Autismo  Levantamento da Genealogia  Testes genéticos (X-fragil; MLPA para regiões 15q, 16p, 22q)  Testes genômicos ? Diretrizes ~ Schaefer et al., 2013, American College of Medical Genetics and Genomics
    38. 38. Por que fazer os testes genéticos?
    39. 39. Síndrome do X Frágil Importante para o Aconselhamento Genético NEGATIVO <10%~50% POSITIVO Frágil X +
    40. 40. Testes Genômicos Array CGH ou exoma: chance de dar positivo ~10-15% Dificuldades:  Custo alto  Dificuldades de interpretação
    41. 41. Testes genômicos: Como podem ajudar? Resultado Negativo Resultado Positivo Resultado Positivo Risco recorrencia: Não MUDA DIMINUI MUDA
    42. 42. Importante avaliar todos os membros da família Risco recorrencia DIMINUI MUDA Resultado positivo Resultado positivo Resultado positivo
    43. 43. Genéticos/Aconselhamento Genético  Compreensão da etiologia  Em alguns casos, é possível predizer risco de epilepsia (melhor acompanhamento e monitoramento)  Risco de recorrência pode ser mais preciso.  Dados genômicos são feitos apenas uma única vez e não vão mudar. Com o avanço do conhecimento, é importante ser reanalisado e novas descobertas podem ser realizadas
    44. 44. Quem Deve Pagar pelo Teste Genético?
    45. 45. Quando e em quem fazer o teste? Individuo com autismo: 3 anos Pais jovens Interesse em ter mais filhos Indivíduo com autismo: 17 anos Pais não desejam ter mais filhos
    46. 46. Universidades e SUS  Estabelecimento de parcerias:  menor custo dos testes genéticos e com controle de qualidade  Estabelecimentos de redes de laboratórios  Estabelecimento de critérios para realização dos testes genéticos  Estabelecimento de redes de pesquisadores de diferentes áreas
    47. 47. Colaboradores atuais FMUSP/Dr. Estevão Vasdaz Elaine Zackai/Inst. Psicologia, USP Andrea Sertié/ Inst. Pesquisa Einstein Alysson Muotri/ UCSD, USAIPEN Andressa Morales Danielle Moreira Eloisa Sá Moreira Isabela Maia Karina G. Kriesi May Suzuki Simone Ferreira Tatiana Almeida Vanessa Naomi Lab-AUTISMO
    48. 48. Obrigada
    49. 49. Células tronco mesenquimais de polpa de dente Análise de Transcriptoma Autista x 6 não Autista

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