Conferência apresentada durante as Jornadas Internacionais de Medicina da Reprodução 2018, Figueira da Foz, PORTUGAL

1. FRAGMENTAÇÃO DE DNA
ESPERMÁTICO:
Que aplicação clínica?
XXXVI Jornadas Internacionais de Medicina da Reprodução
Figueira da Foz - PORTUGAL, Maio 2018
Sandro ESTEVES, MD., PhD.
ANDROFERT & UNICAMP
Campinas – BRASIL

2. ESTEVES, 2
Sandro Esteves, MD., PhD.
• Medical and Scientific Director, ANDROFERT, Campinas, BRAZIL
• Collaborating Professor, Department of Surgery, University of Campinas (UNICAMP), BRAZIL
• Research Collaborator, American Center for Reproductive Medicine, Cleveland Clinic, USA
• Research Collaborator, Genetic Unit, Universidad Autónoma de Madrid, SPAIN
• Honorary Professor of Reproductive Endocrinology, Faculty of Health, Aarhus University,
DENMARK
Declare receipt of honoraria for lectures from Merck, Besins, and Lilly
DISCLOSURE

3. ESTEVES, 3
OBJETIVOS
Ao final desta apresentação, os participantes devem estar aptos:
•Entender importância cromatina espermática e relação
com infertilidade conjugal;
•Apreciar os ensaios existentes medir fragmentação
DNA espermático e saber como utilizá-los;
•Compreender as aplicações clínicas do teste da FDE,
em particular no contexto da reprodução assistida, e o
que fazer para otimizar os resultados terapêuticos.

4. Importância Cromatina Espermática (1)
Sêmen homens inférteis geralmente taxa elevada
fragmentação DNA espermático (FDE)
(em particular, homens alteração seminal)
Evenson et
al, Hum Reprod 1999
Moskovtsev et al, Urology 2009
Esteves et al, Andrologia 2015
Preocupação crescente defeito cromatina
espermática possa ser transferido via TRA
Aitken et al, Nature 2004
ESTEVES, 4

5. Taxas Fragmentação DNA Espermático
Homens Inférteis e Doadores Sêmen
Pacientes
Doadores
Gosalvez et al. J Reprod Biotechnol Fertil. 2015
ESTEVES, 5

6. Importância Cromatina Espermática (2)
FDE associada menor probabilidade gestação natural e
aumento risco aborto espontâneo
- Gestação natural (meta-análise 3 estudos): OR~7, VPP=17%, VPN=58%
Zini et al, Syst Biol Reprod Med 2011
Agarwal et al. Curr Opin Obstet Gynecol 2016
Eisenberg
et al. (LIFE Study) Fertil Steril 2017
Aumento do Tempo até Gravidez (TTP)
Buck et al. (LIFE Study) Fertil Steril 2014
Spano et al. Fertil Steril 2000
Associação FDE & aborto recorrente
Carlini et al. RBM Online 2017
ESHRE Guidelines – RPL - 2017
ESTEVES, 6

7. Esteves et al., Int Urol Nephrol 2014
Quebra
fita única
Pareamento
incorreto
Base danificada Quebra fita
dupla
Ligação
transversal
inter-fita
Ligação
transversal
intra-fita
FRAGMENTAÇÃO DNA ESPERMÁTICO
ESTEVES, 7

8. Mecanismos Biológicos Dano Cromatina
Fernández et al. 2009; Alvarez and Sakkas 2010; Agarwal et al. 2013
ESTEVES, 8
• Falha Protaminação
Espermiogênese
• Estresse Oxidativo Trânsito
Epididimário e Pós-ejaculação
• Apoptose (testículo e
epidídimo)

9. Esteves & Agarwal IBJU 2011;
Cho et al. Asian J Androl 2016

10. Fragmentação DNA Espermático e
Etiologia Infertilidade Masculina
SCD
Esteves et al. Int Urol Nephrol 2015
ESTEVES, 10
N=593

11. Como Medir FDE
Agarwal et al. Transl Androl Urol 2016
TUNEL
Teste da
Estrutura
Cromatina
Espermática
(SCSA)
Dispersão
cromatina
espermática
(Teste do
Halo)
Teste do
Cometa
% Sptz fragmentação
DNA sêmen
ESTEVES, 11

12. UROLOGY 2016; 94: 102–110
ESTEVES, 12

13. Qual o Melhor Ensaio?
Labor-
intensive
Expensive
equipment
Analysis
Subjectivity
Validation
& Standardization
TUNEL ++++ +++ ++ ++
SCSA ++ ++++ + ++++
Comet ++++ ++ ++ ++
SCD + + ++ ++
Esteves et al. Int Urol Nehrol 2014
ESTEVES, 13

14. Dispersão Cromatina Espermática
(Teste do Halo)
1) Etapa denaturação DNA
Gera fragmentos fita única
DNA a partir fitas (única ou
dupla) com quebras pré-
existentes
2) Etapa depleção proteica
Remoção proteínas ligadas
fitas DNA fragmentado
ESTEVES, 14

15. Valores Normalidade
Study SDF assay Cut-off SDF index (%)
Larson-Cook 2003 SCSA <27
Gandini 2004 SCSA <27
Payne 2005 SCSA <27
Bungum 2007 SCSA <30
Speyer 2010 SCSA <19, <30
Simon 2014 SCSA <27
Oleszczuk 2016 SCSA <10, <20
Henkel 2004 TUNEL <36.5
Frydman 2008 TUNEL <35
Esbert 2011 TUNEL <36
Yilmaz 2010 SCD <30
Anifandis 2015 SCD <35
Majzoub et al. Transl Androl Urol 2017
<20% Normal
20-29% Indeterminado
≥30% Elevado
>40% Muito elevado
ESTEVES, 15

16. ESTEVES, 16
’gray zone”: 24,5%
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Frequência Resultados Fragmentação
DNA Espermático (Teste do Halo)
N=1084 (Abstinência ejaculatória: 2-3 dias); Androfert 2016-2017
Elevado: 27%

17. Indeterminado
20-29%
Elevado
≥ 30%
Normal
<20%
Taxa de FDE (Teste do Halo)
Infertilidade Inexplicada
ESTEVES, 17
17%
% Pacientes
Normozoospérmicos e
DFI ≥30%
N=294; Androfert: 2016-2017

18. Transl Androl Urol. 2016; 5: 935-950.
Guideline – Society for Translational Medicine
Aplicação Clínica Teste FDE
ESTEVES, 18

19. 1. Varicocele palpável e sêmen normal ou limítrofe
(espermograma convencional)
2. Infertilidade inexplicada
3. Falha RA (Inseminação intra-uterina, FIV clássica
ou ICSI)
4. Aborto de repetição
5. Fatores risco infertilidade (obesidade, tabagismo,
uso gonadotoxinas)
Agarwal et al. Transl Androl Urol 2016 ;5(6):935-950.
FDE – Aplicação Clínica Baseada Evidência
ESTEVES, 19

20. 1. Varicocele clínica e sêmen normal ou limítrofe
(espermograma convencional)
2. Infertilidade inexplicada
3. Falha RA (Inseminação intra-uterina,
FIV clássica ou ICSI)
4. Aborto de repetição
5. Fatores risco infertilidade (obesidade, tabagismo,
uso gonadotoxinas)
Agarwal et al. Transl Androl Urol 2016 ;5(6):935-950.
FDE – Aplicação Clínica Baseada Evidência
ESTEVES, 20

21. 19%
1,5%
FDE Normal FDE Elevada
Taxas de Nascidos Vivos
IIU em Função FDE
N=387; OR = 0.07
[95% CI: 0.01-0.48]
Bungum et al. Hum Reprod 2007
IIU & FDE
ESTEVES, 21

22. Simon L et al.,
Best Pract Res
Clin Obstet
Gynaecol 2017
FDE & Sucesso Gravidez pós-FIV/ICSI
Tipo Ensaio
TUNEL: OR 1.85 (95% CI 1.52-2.26); P<0.0001
SCD: OR 1.16 (95% CI 1.02-1.32); P=0.023
Comet: OR 4.15 (95% CI 3.04-5.68); P<0.0001
SCSA: OR 1.14 (95% CI 1.04-1.25); P=0.004
70 estudos; 9363 FIV; 6260 ICSI; 2121 misto IVF/ICSI
Método Fertilização
FIV: OR 1.15 (95% CI 1.05-1.27); P=0.003
ICSI: OR 1.12 (95% CI 1.01-1.25); P=0.025
Pós-exclusão fator feminino
1704 ciclos: OR 1.37 (95% CI 1.11-1.68); P=0.003 (independente método)
Esteves, 22 ESTEVES, 22

23. FDE & Aborto pós-FIV/ICSI
RR: 2.2 16 estudos; 2969 casais (95% CI: 1.54–3.03); P<0.00001
Robinson et al, Hum Reprod 2012
Simon et al. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2017
OR~2.3 14 estudos; 2756 casais (95% CI: 1.55–3.35; P<0.001)
ICSI only: OR 2.7 (95% CI: 1.40–5.14; P=0.003)
Zhao et al, Fertil Steril 2014
Clínica RA ~ 1.000 ciclos FIV/ICSI ano
Taxa de gravidez clínica ~40%
Efeito prático: 82 gravidezes a menos
(redução absoluta taxa nascidos vivos ~21%)
Esteves, 23 ESTEVES, 23

24. ESTEVES, 24
IIU, FIV clássica, ICSI
Fragmentação DNA
Espermático
associada menor
probabilidade gravidez
e aumento risco aborto Evidência
1

25. Esteves, 25
O que fazer?

26. Esteves SC. Novel concepts in male factor infertility: clinical and
laboratory perspectives. J Assist Reprod Genet 2016

27. Uso antioxidantes reduz fragmentação DNA
espermático e melhora resultados RA
Parâmetro Magnitude efeito
(OR; 95% CI)
Nascidos Vivos 4.85 [1.92, 12.24]
Fragmentação DNA
espermático
-13.80 [-17.50, -10.10]
Showell et al. Cochrane Database Syst Rev 2011
ESTEVES, 27

28. Como Prescrever AOX
Esteves, 28
Vitamina C 500mg/d
Vitamina E 400 mg/d
Ácido fólico 2 mg/d
Co-enzima Q10 200 mg/d
Zinco 25 mg/d
Selênio 26 mcg/d
L-carnitina 3g/d
Esteves & Agarwal Int Braz J Urol 2011;
Majzoub, Agarwal & Esteves. Antioxidants for elevated sperm
DNA fragmentation: a mini review. Transl Androl Urol. 2017
Conceito antigo ~90 dias
Novo conceito ~60 dias
Duração espermatogênese
Misell et al. J Urol 2006
Mínimo 2 meses
ESTEVES, 28

29. ESTEVES, 29
Cho CL, Esteves SC, Agarwal A. Asian J Androl. 2016
Agarwal A, Hamada A, Esteves SC. Nature Rev Urol. 2012

30. 21 studies (N=1,270) infertile men with varicocele
Unequivocal decrease in SDF rates after varicocele repair in infertile
men with palpable varicocele (21 studies; follow-up 3-12 months)
Postoperative SDF rates significantly lower in men from couples
who achieved pregnancy than those who did not (4 studies)
Concomitant reduction in OS markers after varicocelectomy
(8 studies)
ESTEVES, 30

31. Esteves, 31
• Varicocelectomia
microcirúrgica
pré-ICSI (N=80)
• ICSI com
varicocele clínica
não-tratada
(N=162)
J Urol 2010;184:1442-6
ESTEVES, 31

32. Esteves SC. Novel concepts in male factor infertility: clinical and
laboratory perspectives. J Assist Reprod Genet 2016

33. 26%
42%
IVF ICSI
Pregnancy in cases of elevated
sperm DNA fragmentation
ICSI > FIV clássica casos FDE elevada
Robinson et al. Hum Reprod 2012; Zhao et al. Fertil Steril
2014; Simon et al. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2017
Increased miscarriage,
regardless of whether
IVF or ICSI were used
RR ~ 2.2
95% CI: 1.54-3.03; p<0.00001
Bungum et al. Hum Reprod 2007
ESTEVES, 33

34. Esteves. Eur Urol Focus, in press

35. Muratori et al. Mol Med. 2015
Estresse oxidativo papel central na fisiopatologia da
fragmentação DNA espermático
Esteves, 35
Oxidative attack by free radicals
ESTEVES, 35

36. 5 studies; N=143 patients
SDF levels measured in both
ejaculated sperm and
testicular sperm
Esteves, 36 ESTEVES, 36
Esteves et al. Fertil Steril. 2017
Sep;108(3):456-467

37. SDF rates: Testicular vs. Ejaculated Sperm
Esteves, 37 ESTEVES, 37

38. Esteves et al. Fertil Steril 2015
• Prospective, observational, cohort study with 172 infertile couples
• First IVF-ICSI cycle
• Mild/moderate idiopathic oligozoospermia (5-15x106/mL)
• Persistently elevated SDF (SCD>30%) after 3-month oral AOX
• No detectable female factors, women <40 years old
• Main outcome measures: CPR, LBR, miscarriage
• Powered (80%) to detect a 30% difference in LBR between groups
with a significance level of 5%
Esteves, 38 ESTEVES, 38
172 pacientes com oligozoospermia oligozoospermia (5-15 M/mL) e
taxa elevada fragmentação DNA espermático (FDE>30%) mesmo após
uso AOX
ICSI com espermatozoide
ejaculado (N=91)
ICSI com espermatozoide
testicular (N=81)

39. Esteves et al. Fertil Steril 2015
N=81 Sperm
chromatin
dispersion
(SCD) assay
using dual
fluorescent
cocktail
probe
Esteves, 39 ESTEVES, 39
Fragmentação DNA 5X menor espermatozoides
testiculares em relação espermatozoides ejaculados

40. Study
Infertile male population
studied
No.
patients
DFI
cutoff
(%)
No. (%) SDF
lower in
testicular
sperm
Greco 2005
Non-smokers; Mean count:
26.8 M/ml; Motility: 36.7%;
Morphology: 20.9%
18 15 17 (94.5%)
Moskovtsev 2010 High DFI despite AOX 12 30 11 (91.7%)
Moskovtsev 2012
Mean count: 26.7 M/ml;
Motility: 14.1%; high DFI
despite AOX
8 30 NR
Mehta 2015
Severe oligozoospermia
(<5M/ml)*
24 7 NR
Esteves 2015
Idiopathic oligozoospermia
(5-15 M/mL); high DFI despite
AOX
81 30 81 (100%)
*Men with untreated varicoceles and those with history of testicular trauma, orchiectomy,
chemotherapy, or pelvic radiation excludedEsteves, 40
Com que frequência taxas FDE são menores
na amostra testicular X ejaculada?

41. Study Design Population
No.
patients/
cycles
SDF test
(cutoff)
ICSI Outcome
Greco 2005 Case-control
ICSI failure (≥2);
normozoospermia
1
18
TUNEL
(15%)
2PN, CPR
Esteves 2015 Prospective
Non-ICSI failure;
oligozoospermia
172
SCD
(30%)
2PN, CPR,
miscarriage,
LBR
Pabuccu 2016 Retrospective
ICSI failure (≥2);
normozoospermia
71
TUNEL
(30%)
2PN, CPR
Bradley 2016 Retrospective
Non-ICSI failure;
oligozoospermia1 228
SCIT2
(29%)
2PN, CPR,
miscarriage,
LBR
1calculated mean or median sperm concentration; 2Variation of SCSA
507 ICSI cycles
3,840 injected oocytes
Esteves, 41

42. Esteves et al. Fertil Steril 2017
Testi-ICSI vs Ejac-ICSI
for high post-testicular SDF
Esteves, 42 ESTEVES, 42

43. Esteves et al. Fertil Steril 2017
Testi-ICSI vs Ejac-ICSI
for high post-testicular SDF
Esteves, 43 ESTEVES, 43

44. Esteves et al. Fertil Steril 2017
Testi-ICSI vs Ejac-ICSI
for high post-testicular SDF
Esteves, 44 ESTEVES, 44

45. Esteves et al. Fertil Steril 2015
• Prospective, observational, cohort study with 172 infertile couples
• First IVF-ICSI cycle
• Mild/moderate idiopathic oligozoospermia (5-15x106/mL)
• Persistently elevated SDF (SCD>30%) after 3-month oral AOX
• No detectable female factors, women <40 years old
• Main outcome measures: CPR, LBR, miscarriage
• Powered (80%) to detect a 30% difference in LBR between groups
with a significance level of 5%
Esteves, 45 ESTEVES, 45
172 pacientes com oligozoospermia oligozoospermia (5-15 M/mL) e
taxa elevada fragmentação DNA espermático (FDE>30%) mesmo após
uso AOX
ICSI com espermatozoide
ejaculado (N=91)
ICSI com espermatozoide
testicular (N=81)

46. Prospective cohort study of testicular vs. ejaculated
sperm in men with high SDF undergoing ICSI
Esteves et al. Fertil Steril 2015
ESTEVES, 46

47. Esteves et al. Fertil Steril 2015
NNT by Testi-ICSI compared with Ejac-ICSI to
achieve each additional LB/transfer was
4.9 (95% CI 2.8-16.8)
Esteves, 47 ESTEVES, 47
Prospective cohort study of testicular vs. ejaculated
sperm in men with high SDF undergoing ICSI

48. Strengths
• Testicular sperm have
better chromatin integrity
• Testi-ICSI associated with
better ART outcomes
Weaknesses
• Limited evidence
• Potential confounders
• Nature of SDF
Threats
• Surgical complications
• Health of offspring
Opportunities
• Confirmatory evidence
• Identification best candidates
• Cost-effectiveness
Esteves, 48Esteves, 48 ESTEVES, 48

49. • Retrospective cohort
• General IVF-ICSI population
• Elevated SDF>29%
• Blastocyst Transfer
Esteves, 49
24.9% 24.0%
32.7%
43.7%
None IMSI PICSI Testi-ICSI
Live Birth in High SDF Patients by Intervention
NS
P=0.02
NS
ESTEVES, 49
Bradley et al. Andrology 2016

50. Health of offspring: testicular sperm for ICSI
Region N Outcome Main findings
Palermo et al.
1999
USA 22 Congenital
abnormalities
No difference with obstructive
azoospermia (4.5% vs 1.3%)
Vernaeve et al.
2005
Belgium 61 Perinatal data;
Congenital
abnormalities
Lower gestational age (singletons);
Increased frequency of premature twins;
No difference with OA (4% vs 3%)
Fedder et al
2007
Denmark 76 Congenital
abnormalities
No difference with other infertility
categories (0% vs 4.0%)
Belva et al.;
2011
Belgium 193 Perinatal data;
Congenital
abnormalities
Similar perinatal outcomes; no
difference NOA (4.2%) vs. OA (5.2%)
Esteves et al.
2014
Brazil 113 Obstetric
outcomes;
Perinatal data;
congenital
abnormalities
Similar obstetric and perinatal outcomes
between OA and NOA; No difference
malformation rate OA (1.5%) vs NOA
(2.1%)
Esteves & Agarwal, Clinics 2013; Esteves et al. Asian J Androl 2014
ESTEVES, 50

51. Esteves, 51
• Survey study
• 49 participants
• 19 countries
• SDF testing requested by ~80% responders
• Test method: TUNEL (30.6%), SCSA (30.6%), SCD (Halo; 20.4%)
• Cost: 170 ± 123 USD
• Indications:
- Unexplained failure or miscarriage after IVF (91.8%)
- Recurrent natural pregnancy loss (85.7%)
- Unexplained failure or miscarriage after ICSI (85.7% )
• 67.3% responders admitted abnormal SDF would
affect their decision to utilize testicular instead of
ejaculated sperm for ICSI
ESTEVES, 51

52. ESTEVES, 52
CONCLUSÕES (1)
• Sêmen homens inférteis frequentemente apresenta
fragmentação DNA espermático
• FDE associada menor probabilidade de gravidez
(natural & TRA) e maior probabilidade de aborto
• Preocupação possível transmissão defeitos
cromatina espermática via TRA (ICSI)
FRAGMENTAÇÃO DE DNA ESPERMÁTICO: Que aplicação clínica?

53. ESTEVES, 53
CONCLUSÕES (2)
•Teste FDE avalia cromatina nível molecular
complementar à análise seminal conventional
FRAGMENTAÇÃO DE DNA ESPERMÁTICO: Que aplicação clínica?
1. Varicocele palpável e sêmen normal ou limítrofe
2. Infertilidade inexplicada
3. Aborto de repetição
4. Fatores risco infertilidade (obesidade, tabagismo, gonadotoxinas)
5. Falha unexplicada/aborto pós-FIV & ICSI
•5 aplicações (baseadas evidência) auxílio manejo clínico:

54. ESTEVES, 54
CONCLUSÕES (3)
FRAGMENTAÇÃO DE DNA ESPERMÁTICO: Que aplicação clínica?
1. Aconselhamento casal infértil quanto aos riscos uso
sêmen com taxa elevada FDE
2. Identificação fator causal FDE e tratamento (se factível)
3. ICSI técnica de reprodução assistida de escolha
4. Espermatozoide Testicular deve ser considerado casais
com falha repetida TRA
•Manejo clínico casais submetidos TRA:

55. MUITO OBRIGADO
https://www.slideshare.net/sandroesteves/presentations