Programa de Pós-Graduação em Microbiologia
Biologia Molecular de Micro-organismos (MIC842)
ICB/UFMG
PCR quantitativa
Teori...
• PCR
 Histórico
 Teoria
 Aplicações
• Desenho de primers
• qPCR
 Metodologias
Cálculos
 Aplicações
 PCR Digital
Dogma central da Biologia Molecular
• Francis Crick / 1956
PCRPCR
PCR - Polymerase Chain Reaction
Funções da PCR
• Distinguir uma sequência-alvo específica de uma
grande quantidade de background;
• Amplificação de cópias...
Aplicações da PCR “convencional”
• Diagnóstico
• Avaliação de mutações
• Detecção de patógenos (bactérias, fungos, vírus, ...
PCR “convencional”
Reagentes básicos
Iniciadores
senso/antissenso
(primers forward/reverse)
Cátions
(Na+
/K+
e Mg2+
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Importância do tampão e íon potássio na PCR
• pH 8,3  pH 7,2 a 72º C
• Tris/ Tris-Cl
•Função enzimática da DNA polimerase...
Importância dos dNTPs e íon magnésio na PCR
• Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
• Associados ao DNA na forma de dNMPs
•...
Função e relevância dos primers
• Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de
sequência complementar e flanqueadora à ...
Thermus aquaticus
DNA polimerase termorresistente
• Antigamente: adição de enzima a cada novo ciclo
• Taq DNA Polimerase
•...
DNA molde
• Qualidade
• Cuidado com resíduos de processos de extração
• SDS (dodecil sulfato de sódio)
• Fenol
• Corantes
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Parâmetros de termociclagem
• Temperatura de anelamento
↑ Tanelamento  ↑estringência
↓produtos inespecíficos
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Aditivos
• Separação de fitas com alto conteúdo G:C
• Estruturas secundárias fortes
• Betaína (1 M)
• DMSO (1-10%)
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Inibidores
• Derivados das próprias amostras ou do método
de extração/purificação do ácido nucléico;
• Fenol/álcoois
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Fonte: Koch WH, 2004. Nature Reviews Drug Discovery 3, 749-761 (Sep 2004)
Visualização dos resultados
• Separação por eletroforese
• Corantes/marcação fluorescente
Visualização dos resultados
• Sequenciamento capilar
• Dideoxinucleotídeos
Antes da PCR...
• Clonagem!
Antes dos termocicladores...
• Banho-maria!
Desenho deDesenho de
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Características de bons primers
• Tamanho adequado
• 15 a 25 pares de bases
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Características de bons primers
• Tamanho do fragmento a ser gerado
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Características de maus primers
• Inter-complementariedade
• Formação de dímeros (primer dimer)
• Atenção à extremidade 3´
Características de maus primers
• Auto-complementariedade
• Formação de auto-dímeros e hairpins
Características de bons primers
• Adequação para qPCR
• Tamanho do amplicon
•Junção exon-exon e contaminação com gDNA
Ferramentas online de suporte
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• Nomenclatura
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• qRT-PCR
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• SYBR Green I
• Ensaio para 5´-nuclease (TaqMan)
• Molecular Beacons
• LightCycler
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SYBR Green I
• Corante específico para DNA de fita dupla
• Flourescência aumenta ao longo da reação
• Não tem ação inibitó...
Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan
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• Altamente específica, sem produto...
FRET - Transferência de energia por ressonância
fluorescente
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próximas (10 –...
Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan
Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan
• Discriminação alélica
Conceitos importantes
• Fases exponencial, logarítmica e plateau
• Threshold
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Ciclos
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Ciclos
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Amostra A 3 6 12 24 48 96 192 384 768 1536 3072
Amostra B 15 30 60 120 240 480 960 1920 3840...
↑ CT ↓ Qtde. inicial↑ CT ↓ Qtde. inicial
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Conceitos importantes
• Quantidade inicial de amostra
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Conceitos importantes
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Conceitos importantes
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Conceitos importantes
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Conceitos importantes
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Conceitos importantes
• Curva-padrão e blank sample
• Gene de referência/constitutivo/normalizador
• Gene de interesse
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Conceitos importantes
• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Indica a temperatura em que 50% dos primers
estão anelad...
Conceitos importantes
• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Diretamente relacionada ao conteúdo G:C
• Pode apontar a...
Conceitos importantes
• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Importante para distinção de amplicons/primers
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Fatores que afetam a eficiência da qPCR
• DNA degradado
• Produtos inespecíficos
• Tamanho do amplicon
• Condições de term...
Funções da PCR quantitativa
• Quantificação absoluta
• Curvas-padrão
• Quantidade conhecida de “cópias por volume”
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CÁLCULOS E
ANÁLISES
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biológicas e técnicas
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• Método PfafflMétodo Pfaffl  Curva de cópias (plas...
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• Relação matemática entre a expressão dos genes
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Cálculos em qPCR – Quantificação relativa
• Avaliada a conformidade de todos os outros
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GAPDH IFN-γ
Amostra 1 15,1 32,5 17,4 1,08 0,47
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Amostra 3 16 32,8 16,8 0,48 0,72
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Extração e manuseio de ácidos nucléicos
• RNA = extremamente lábil!
• Armazenamento correto
• Dosagem e normalização das a...
Escolha do gene de referência
• É necessário ter opções!
• Ex.: 18S, GAPDH, RPL4, HPRT para camundongo
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Antes da qPCR...
• Northern Blotting (RNA)
• Southern Blotting (DNA)
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PCR digital (dPCR)
Baseada na compartimentalização da amostra
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Fonte: Baker M, 2012. Nature Methods 9, 541 (Jun 2012)
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• Teoria e suas diferenças entre as técnicas
• Vantagens e desvantagens de cada uma
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Lucas Secchim Ribeiro
secchimribeiro@gmail.com
Dpto. Microbiologia
Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro
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PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)
PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)
PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)
PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)
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PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)

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Aula ministrada durante a disciplina de Biologia Molecular de Microrganismos, no Programa de Pós-Graduação em Microbiologia da Universidade Federal de Minas Gerais.

Publicada em: Educação

PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)

  1. 1. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Biologia Molecular de Micro-organismos (MIC842) ICB/UFMG PCR quantitativa Teoria e Aplicações Lucas Secchim Ribeiro Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro
  2. 2. • PCR  Histórico  Teoria  Aplicações • Desenho de primers • qPCR  Metodologias Cálculos  Aplicações  PCR Digital
  3. 3. Dogma central da Biologia Molecular • Francis Crick / 1956
  4. 4. PCRPCR
  5. 5. PCR - Polymerase Chain Reaction
  6. 6. Funções da PCR • Distinguir uma sequência-alvo específica de uma grande quantidade de background; • Amplificação de cópias de uma sequência específica a partir de pequenas quantidades do DNA modelo.
  7. 7. Aplicações da PCR “convencional” • Diagnóstico • Avaliação de mutações • Detecção de patógenos (bactérias, fungos, vírus, protozoários) • Tipagem para transplantes - MHC • Testes forenses • Paternidade • Investigações criminais • Sequenciamento e clonagem • Epidemiologia molecular e bioinformática • Análise de OGM • ...
  8. 8. PCR “convencional” Reagentes básicos Iniciadores senso/antissenso (primers forward/reverse) Cátions (Na+ /K+ e Mg2+ ) DNA polimerase com DNA modelo Deoxinucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
  9. 9. Importância do tampão e íon potássio na PCR • pH 8,3  pH 7,2 a 72º C • Tris/ Tris-Cl •Função enzimática da DNA polimerase • K+ • Reduz a repulsão entre DNA/DNA e DNA/primer pela neutralização de cargas negativas ↑ [K+ ] para fragmentos pequenos ↓ [K+ ] para fragmentos grandes
  10. 10. Importância dos dNTPs e íon magnésio na PCR • Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs) • Associados ao DNA na forma de dNMPs • Sequestradores de Mg2+ • Mg2+ • Cofator da DNA polimerase • Especificidade e eficiência da enzima •Estabiliza ligação de dNTP/dNMP e primers à fita de DNA (↑ Tm) • Rendimento x Concentração crítica e empírica ↑ [Mg2+ ]  ↑eficiência ↓especificidade
  11. 11. Função e relevância dos primers • Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de sequência complementar e flanqueadora à fita molde, com a extremidade 3´-OH livre
  12. 12. Thermus aquaticus DNA polimerase termorresistente • Antigamente: adição de enzima a cada novo ciclo • Taq DNA Polimerase • Dependente de cátions bivalentes (Mg2+ > Mn2+ >>>Ca2+ ) • Inibição por agentes quelantes (EDTA, citrato) Parque Nacional de Yellowstone / EUA
  13. 13. DNA molde • Qualidade • Cuidado com resíduos de processos de extração • SDS (dodecil sulfato de sódio) • Fenol • Corantes • Heparina/EDTA/Citrato • Polissacarídeos vegetais/carragenina • Poliestireno/polipropileno expostos à radiação UV • Quantidade • Excesso de DNA é prejudicial • Aumento de reação inespecífica
  14. 14. Parâmetros de termociclagem • Temperatura de anelamento ↑ Tanelamento  ↑estringência ↓produtos inespecíficos ↓ Tanelamento  ↑rendimento ↑ produtos inespecíficos • Tempo de extensão • DNA Polimerase: 35 – 100 nt por segundo a 72º C • Mínimo = 1 minuto • Excesso  Atividade de exonuclase 5´-3´
  15. 15. Aditivos • Separação de fitas com alto conteúdo G:C • Estruturas secundárias fortes • Betaína (1 M) • DMSO (1-10%) • Formamida (1-10%) • Agentes estabilizantes da DNA polimerase • Redução da adesão de reagentes ao tubo • BSA (0,1 mg/mL) • Gelatina (0,1 – 1,0%) • Detergentes não-iônicos (<0,5%)
  16. 16. Inibidores • Derivados das próprias amostras ou do método de extração/purificação do ácido nucléico; • Fenol/álcoois • EDTA • Debris celular • Detergentes
  17. 17. Fonte: Koch WH, 2004. Nature Reviews Drug Discovery 3, 749-761 (Sep 2004)
  18. 18. Visualização dos resultados • Separação por eletroforese • Corantes/marcação fluorescente
  19. 19. Visualização dos resultados • Sequenciamento capilar • Dideoxinucleotídeos
  20. 20. Antes da PCR... • Clonagem!
  21. 21. Antes dos termocicladores... • Banho-maria!
  22. 22. Desenho deDesenho de primersprimers
  23. 23. Características de bons primers • Tamanho adequado • 15 a 25 pares de bases • Tamanho x Temperatura de dissociação • Temperatura adequada de dissociação (Tm) • Conteúdo G:C •Diferença entre primers < 5º C
  24. 24. Características de bons primers • Tamanho do fragmento a ser gerado • Tempo de extensão da polimerase •Especificidade  Primers específicos x degenerados
  25. 25. Características de maus primers • Inter-complementariedade • Formação de dímeros (primer dimer) • Atenção à extremidade 3´
  26. 26. Características de maus primers • Auto-complementariedade • Formação de auto-dímeros e hairpins
  27. 27. Características de bons primers • Adequação para qPCR • Tamanho do amplicon •Junção exon-exon e contaminação com gDNA
  28. 28. Ferramentas online de suporte • Primer-BLAST www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ • Primer3 bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3 • IDT Oligo Analyzer 3.1 www.idtdna.com/calc/analyzer • UCSC PCR in silico genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start • RT Primer DB (específico para qPCR) • medgen.ugent.be/rtprimerdb
  29. 29. Problema detectado Workflow para desenho de primers Verificar • Temp. de anelamento • Temp. de dissociação • Tamanho do amplicon • Estruturas secundárias • Complementaridade • EspecificidadeNãoSim PCR para confirmação de funcionamento PCR para confirmação de funcionamento GenBank/NCBI Encontrar sequência da região desejada Encontrar sequência da região desejada PrimerBLAST Primer3, etc Desenhar primersDesenhar primers Registrar e arquivar resultados obtidos Registrar e arquivar resultados obtidos Reação adequada OK?OK? CHECAR PRIMERS!CHECAR PRIMERS!
  30. 30. PCRPCR quantitativaquantitativa
  31. 31. PCR quantitativa • Nomenclatura • qPCR • qRT-PCR • Real-time PCR
  32. 32. Ensaios químicos disponíveis • SYBR Green I • Ensaio para 5´-nuclease (TaqMan) • Molecular Beacons • LightCycler • LUX Detecção de fluorescência! ↑ sensibilidade
  33. 33. SYBR Green I • Corante específico para DNA de fita dupla • Flourescência aumenta ao longo da reação • Não tem ação inibitória • Detecta produtos inespecíficos SYBR Green I Brometo de etídio
  34. 34. Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan • Atividade 5´-nucleásica da Taq DNA Polimerase • Altamente específica, sem produtos espúrios • Duas marcações simultâneas são possíveis • Tecnologia baseada em FRET • Flourescence Resonance Energy Transfer
  35. 35. FRET - Transferência de energia por ressonância fluorescente • Fenômeno quântico entre duas moléculas muito próximas (10 – 100 Å), com bloqueio da emissão de luz • Quencher/bloqueador
  36. 36. Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan
  37. 37. Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan • Discriminação alélica
  38. 38. Conceitos importantes • Fases exponencial, logarítmica e plateau • Threshold • Baseline • Cycle threshold (CT) Ciclos Flourescência (produtosdePCR) Plateau Linear Exponencial Threshold
  39. 39. Ciclos 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Amostra A 3 6 12 24 48 96 192 384 768 1536 3072 Amostra B 15 30 60 120 240 480 960 1920 3840 7680 15360 ~7,05 ~9,38
  40. 40. ↑ CT ↓ Qtde. inicial↑ CT ↓ Qtde. inicial Quantidade inicial CT Amostra A 3 9,38 Amostra B 15 7,05
  41. 41. Conceitos importantes • Quantidade inicial de amostra • Relação CT x Quantidade inicial
  42. 42. Conceitos importantes • Eficiência 2n = cópias em n ciclos Eficiência teórica= 100%
  43. 43. Conceitos importantes • Eficiência Qtde. inicial de DNA 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1
  44. 44. Log 10 da qtde. inicial 0 1 2 3 4 5 6 7 8 CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1 Conceitos importantes • Eficiência
  45. 45. E = 10(-1/slope) Conceitos importantes • Eficiência Eficiência 100% = 2n a cada ciclo = log 2 x Para um aumento de 10x = log 2 10 = 3,32 Slope (inclinação)
  46. 46. Conceitos importantes • Curva-padrão e blank sample • Gene de referência/constitutivo/normalizador • Gene de interesse Controle Infectado GAPDH IFN-γ Relação GAPDH IFN-γ Relação Amostra 1 20 20 1 5 40 8,0 Amostra 2 30 40 1,33 5 20 4,0 Amostra 3 60 80 1,33 10 50 5,0 Amostra 4 50 60 1,2 15 80 5,33 Amostra 5 40 50 1,25 10 60 6,0 Média + EPM 1,22 + 0,06 Média + EPM 5,66 + 0,67
  47. 47. Conceitos importantes • Curva de dissociação (Curva de melting) • Indica a temperatura em que 50% dos primers estão anelados; • Ligação específica do corante à fita dupla
  48. 48. Conceitos importantes • Curva de dissociação (Curva de melting) • Diretamente relacionada ao conteúdo G:C • Pode apontar amplificação inespecífica e dímeros de primers
  49. 49. Conceitos importantes • Curva de dissociação (Curva de melting) • Importante para distinção de amplicons/primers em protocolos multiplex
  50. 50. Fatores que afetam a eficiência da qPCR • DNA degradado • Produtos inespecíficos • Tamanho do amplicon • Condições de termociclagem • Prática laboratorial inadequada • Reagentes contaminados • Primers mal desenhados • Diluições mal feitas • Falta de calibração e manutenção • Pipetagem errada!
  51. 51. Funções da PCR quantitativa • Quantificação absoluta • Curvas-padrão • Quantidade conhecida de “cópias por volume” • Semelhante a um ELISA • Exemplos: carga viral, 16S bacteriano • Avaliação relativa • Ausência de curva-padrão • Gene de referência para normalização • Apresentada em aumento/redução em relação a um controle experimental • Exemplo: expressão gênica
  52. 52. CÁLCULOS E ANÁLISES CÁLCULOS E ANÁLISES Verificar dispersão entre replicatas biológicas e técnicas Verificar dispersão entre replicatas biológicas e técnicas Checar controles positivos (curva-padrão) e negativos (blank) Checar controles positivos (curva-padrão) e negativos (blank) Conferir curvas de dissociação (Tm)Conferir curvas de dissociação (Tm) Verificar ajuste do thresholdVerificar ajuste do threshold Análise de resultados Avaliar as curvas de amplificaçãoAvaliar as curvas de amplificação
  53. 53. Cálculos em qPCR – Quantificação absoluta • Regressão linear simples • Método PfafflMétodo Pfaffl  Curva de cópias (plasmídeos)Curva de cópias (plasmídeos)
  54. 54. Cálculos em qPCR – Quantificação relativa • Relação matemática entre a expressão dos genes de referência e os de interesse • Método LivakMétodo Livak  22--ΔΔΔΔCTCT
  55. 55. Cálculos em qPCR – Quantificação relativa • Avaliada a conformidade de todos os outros parâmetros, a única informação útil será o CT • Exemplo: Controle Infectado GAPDH IFN-γ GAPDH IFN-γ Amostra 1 15,1 32,5 14,9 29,4 Amostra 2 15,4 33,1 15,5 29,1 Amostra 3 16,0 32,8 15,1 28,8 Amostra 4 18,1 31,5 15,8 29,9 Amostra 5 15,7 32,0 15,5 28,9
  56. 56. GAPDH IFN-γ Amostra 1 15,1 32,5 17,4 1,08 0,47 Amostra 2 15,4 33,1 17,7 1,38 0,38 Amostra 3 16 32,8 16,8 0,48 0,72 Amostra 4 18,1 31,5 13,4 -2,92 7,57 Amostra 5 15,7 32 16,3 -0,02 1,01 GAPDH IFN-γ Amostra 1 14,9 29,4 14,5 - -1,82 3,53 Amostra 2 15,5 29,1 13,6 - -2,72 6,59 Amostra 3 15,1 28,8 13,7 - -2,62 6,15 Amostra 4 15,8 29,9 14,1 - -2,22 4,66 Amostra 5 15,5 28,9 13,4 - -2,92 7,57 Controle Infectado ΔCT ΔΔCT 2 -ΔΔCT ΔCT Média ΔCT 16,32 Média ΔCT ΔΔCT 2 -ΔΔCT
  57. 57. Extração e manuseio de ácidos nucléicos • RNA = extremamente lábil! • Armazenamento correto • Dosagem e normalização das amostras • A260/280 e A260/230 > 1,8 • Contaminação com DNA genômico Confecção de cDNA • Normalizar a mesma quantidade (p.e. 2 µg) de RNA para todas as amostras; • Todo o procedimento deve ser realizado no gelo; • Ciclos de congelamento/descongelamento;
  58. 58. Escolha do gene de referência • É necessário ter opções! • Ex.: 18S, GAPDH, RPL4, HPRT para camundongo • Diferentes estímulos/tecidos/tratamentos podem ter a expressão do gene constitutivo alterada; •Preparar um pool com amostras-controle • 6 diluições em triplicata • Diferença entre o CT mínimo e máximo < 1,0 •Algoritmos gratuitos na internet •NormFinder: macro para Excel
  59. 59. Antes da qPCR... • Northern Blotting (RNA) • Southern Blotting (DNA)
  60. 60. PCRPCR digitaldigital
  61. 61. PCR digital (dPCR) Baseada na compartimentalização da amostra • Gotículas (droplets) em emulsão = microfluidos • Chips com nanopoços Individualização das moléculas! Distribuição de Poisson Aplicações • Quantificação absoluta sem curva-padrão • Expressão gênica • Detecção de alelos raros e/ou mutações • Discriminação de baixas diferenças para CNV
  62. 62. Sample DNA Target
  63. 63. Fonte: Baker M, 2012. Nature Methods 9, 541 (Jun 2012)
  64. 64. http://www.gene-quantification.de/
  65. 65. O que é importante saber? • Teoria e suas diferenças entre as técnicas • Vantagens e desvantagens de cada uma • Como aplicar a PCR ao seu projeto • Aplicações gerais e específicas • Boas práticas laboratoriais
  66. 66. Lucas Secchim Ribeiro secchimribeiro@gmail.com Dpto. Microbiologia Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro Sala C4 191 – Ramal 2735

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