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Alexandra Carvalho – Diego Meneses – Eveny Costa – Fabiana Sátiro – Felipe Rodolfo
– Illy Gomes – Larissa Pessoa – Mayck Barbosa – Rosa Viana –
Universidade Federal do Piauí
Campus de Parnaíba
Disciplina: Práticas em Biomedicina I
Professora: France Keiko N. Yoshioka
Biomedicina 2012-02
Exames realizados na área de Genética Médica
• Genética Médica
Biologia Molecular
Citogenética
Genética Médica no Brasil
Aplicações
• Testes genéticos pré-natais,
• Testes de pacientes sintomáticos;
• Testes de indivíduos assintomáticos;
• Com risco potencial de desenvolver mutações.
Introdução
Distúrbios
genéticos
Cromossômico
Estruturais
Numéricas
Gênico
Deleção
Adição
Inversão
Translocação
Distúrbios
genéticos
A nível
cromossômico
Estruturais
Numéricas
Exames laboratoriais referentes à:
Cariotipagem
Cariotipagem
Passo I
• Colheita – punção venosa,
• Cultivo;
• Adição de agentes estimulantes da mitose in vitro;
• Inibir a mitose em metáfase;
• Ruptura da célula e do núcleo celular;
• Coloração e visualização em lâmina.
Passo II
• Cromossomos organizados pelo tamanho e posição do centrômero
→Acrocêntricos - NORs
→Submetacêntricos
→Metacêntricos
Técnicas de coloração do cariótipo
• Bandeamentos G
• Bandeamento Q
• Bandeamento R
• Bandeamento C
• Bandeamento de alta resolução (pró-metafásico)
• Cariotipagem espectral (SKY)
• Células nucleadas,
• Amostras sangue periférico, sangue fetal, líquido amniótico;
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• Permite a contagem do número de cromossomos;
• Permite avaliar a qualidade dos preparados cromossômicos.
Coloração convencional
Técnica mais usada;
tratamento com
tripsina (desnaturante
proteico) e coloração
com Giemsa
Cada par de
cromossomas cora
segundo um padrão
de bandas clara e
escuras (bandas G)
Coloração com
quinacrina mostarda (ou
outros semelhantes);
observação ao
microscópio de
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segundo um padrão
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coloração com Giemsa
ou flurocromo(
Acridina)
Bandas escuras e
claras (bandas R)
estão invertidas
relativamente ao
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Bandeamento G
Bandeamento Q
Bandeamento R
Síndrome de Down
Bandeamento G
Bandeamento Q
Bandeamento R
• Coloração que contém heterocromatina constitutiva ;
• Partes: centrômeros e partes dos cromossomos e braços
longos dos cromossomos 1,9,16 e Y.
Bandeamento C
Procedimentos especiais
Infertilidade
Síndrome de DiGeorge
• Usado com técnicas de bandeamentos G ou R,
• Estágios iniciais da mitose, prófase e pró – metáfase;
• Útil principalmente para microdeleções cromossômicas -
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Metáfase.
Bandeamento de alta resolução
Cariotipagem espectral (SKY)
• Cromossomos de uma
célula de uma só vez,
• Cores fluorescentes;
• 24 diferentes espectros
fluorescentes sendo o 23 ª
e 24ª para o cromossomo X
e Y;
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para análise de imagem.
ATAXIA
O que essas técnicas nos permitem diagnosticar?
→Euploidia múltiplo exato do conjunto cromossômico
(tetraploidia)
→Aneuploidia qualquer outro número que não seja múltiplo do
conjunto genômico (monossomia , trissomia)
• Síndrome de Down (trissomia do 21)
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Translocações recíprocas – troca de segmentos entre cromossomos
Distúrbios genéticos A nível gênico
Deleção
Adição
Inversão
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Exames laboratoriais referentes à:
FISH - hibridização in situ por
fluorescência
• Preparação de sondas específicas de DNA.
• Kits pelos laboratórios de citogenética.
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→ Método direto
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• Preparação dos cromossomos.
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aquecimento em solução de formamida (70C).
Exames realizados na área de Genética Médica
Exames realizados na área de Genética Médica
• Leucemia Mieloide Crônica (LMC)
→ Cromossomo Filadélfia
FISH - Aplicações
FISH - Aplicações
• Síndrome Cri-du-chat
 Microdeleção
Detecção de aneuploidias – Trissomia do 21
PCR
Extração e purificação do DNA
1. Tampão de extração (EDTA, SDS em pH básico),
2. Adicionar Proteinase K;
3. Adicionar RNAse;
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6. Adicionar Clorofórmio/ álcool isoamílico;
8. Adicionar Acetado de Na 3M e etanol gelado.
• DNA molde,
• Primers (delimitam a sequência a ser amplificada);
• DNA polimerase (Taq polimerase);
• dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP);
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• Cloreto de magnésio (íons Mg2+).
Componentes básicos necessários para
realização de uma reação de PCR:
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Hibridização dos primes
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A técnica da PCR
Cuidados especiais nas reações de PCR
• A alta sensibilidade.
• Qualquer sequência alvo de DNA pode ser amplificada
por PCR.
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Possíveis fontes de contaminação da PCR
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Métodos de coleta de amostras Tubos de reagentes/vidraria
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Componentes básicos para a realização de uma RT‐PCR
• Transcriptase reversa,
• DNA polimerase;
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1ª Etapa (37° C)
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Eletroforese
• Preparação do gel,
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Procedimentos de Eletroforese
Preparação do
gel
solidificação Tampão TBE
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Aplicar a amostraLigar a fonte
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Eletroforese
• Estudos da relação patógeno-hospedeiro,
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→ Diagnóstico pré‐natal.
• Diagnóstico pré‐natal e detecção de portadores da distrofia muscular
Duchenne envolvendo a triagem de deleções e duplicações usando a reação
em cadeia da polimerase (PCR) multiplex. O paciente 1 não tem as bandas
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Aplicações da PCR e Eletroforese de DNA
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• Mutação no códon (GAG > GTG) elimina um sítio de restrição da Enzima DdeI ;
assim após a digestão o alelo normal gera 3 fragmentos: 201, 88 e 87 pb e o alelo
mutante 2 fragmentos: 288 e 88pb.
Southern Blot
• É um método de análise de ácidos nucleicos que
permitem mapear fragmentos de DNA de interesse em
uma coleção de fragmentos que é o nosso genoma.
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de pessoas.
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grande parte deles, assim como inserções e deleções.
Doença Tipo de mutação Teste
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frágil
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(CGG) na região promotora
do gene FMR1
PCR associado à Southern
blot
Distrofia de Becker
e Duchenne
Mutações do tipo deleção e
duplicação no gene da
distrofia (DMD).
PCR e Souther blot para
detecção de deleções
Southern Blot
DNA digerido por uma
enzima de restrição
Separação dos fragmentos
em gel de agarose
Transferência dos fragmentos do gel
para uma membrana de
nitrocelulose
Membrana com os
fragmentos transferidos
Hibridização com sonda
marcada radioativamente
Autorradiografia: as bandas
correspondem a fragmentos
onde a sonda hibridizou
Northern Blot
• Análise do RNA,
• Desnaturação antes da Eletroforese em gel com adição
de formaldeído;
• Depois da eletroforese o RNA é transferido para um
filtro incubado com uma sonda desnaturada, marcada
que hibridiza o RNA específico;
• Exposição do filtro ao raio X.
Separação dos fragmentos
em gel de agarose
Transferência dos fragmentos do gel
para uma membrana de
nitrocelulose
Membrana com os
fragmentos transferidos
Hibridização com sonda
marcada radioativamente
Autorradiografia: as bandas
correspondem a fragmentos
onde a sonda hibridizou
Purificação do RNA
Northern Blot
Dot blot
Trata-se de uma metodologia que permite detectar
biomoléculas. É uma simplificação da metodologia de
Southern blot, northern blot e westhern blot.
• Moléculas não são separadas por eletroforese,
• Aplicadas diretamente a um suporte sólido como um
ponto (dot);
• A membrana é submetida ao processo de desnaturação é
hibridizada com a sonda de interesse.
Indicações
Em casos em que a mutação investigada é prevalente na
população investigada, ou seja, a mutação de uma base ou
um pequeno número de bases é responsável por uma fração
significativa de casos da doença naquela população.
Westhern Blot
Também conhecido como protein blotting ou
immunoblotting, é um poderoso e importante método em biologia
molecular utilizado para imunodetecção de proteínas após a
separação destas por eletroforese em gel e transferência para
membrana adsorvente.
A genética médica e o
futuro
Alexandra Carvalho – Diego Meneses – Eveny Costa – Fabiana Sátiro – Felipe Rodolfo
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Universidade Federal do Piauí
Campus de Parnaíba
Disciplina: Práticas em Biomedicina I
Professora: France Keiko N. Yoshioka
Biomedicina 2012-02
Referências Bibliográficas
• BAMOHAD, J. G. Genética Médica. Elsevier. 2010. capítulo 6.
Citogenética Clínica: A base cromossômica da doença humana.
• NASSBAUM, et al. Tompson & Tompson. Guanabara Koogan. 2002.
Capítulo 9. Fundamentos de citogenética.

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  • 1. Alexandra Carvalho – Diego Meneses – Eveny Costa – Fabiana Sátiro – Felipe Rodolfo – Illy Gomes – Larissa Pessoa – Mayck Barbosa – Rosa Viana – Universidade Federal do Piauí Campus de Parnaíba Disciplina: Práticas em Biomedicina I Professora: France Keiko N. Yoshioka Biomedicina 2012-02
  • 3. • Genética Médica Biologia Molecular Citogenética Genética Médica no Brasil
  • 4. Aplicações • Testes genéticos pré-natais, • Testes de pacientes sintomáticos; • Testes de indivíduos assintomáticos; • Com risco potencial de desenvolver mutações.
  • 7. Cariotipagem Passo I • Colheita – punção venosa, • Cultivo; • Adição de agentes estimulantes da mitose in vitro; • Inibir a mitose em metáfase; • Ruptura da célula e do núcleo celular; • Coloração e visualização em lâmina. Passo II • Cromossomos organizados pelo tamanho e posição do centrômero →Acrocêntricos - NORs →Submetacêntricos →Metacêntricos
  • 8. Técnicas de coloração do cariótipo • Bandeamentos G • Bandeamento Q • Bandeamento R • Bandeamento C • Bandeamento de alta resolução (pró-metafásico) • Cariotipagem espectral (SKY)
  • 9. • Células nucleadas, • Amostras sangue periférico, sangue fetal, líquido amniótico; • Pareamento dos cromossomos homólogos; • Rápido, fácil e baixo custo; • Permite a contagem do número de cromossomos; • Permite avaliar a qualidade dos preparados cromossômicos. Coloração convencional
  • 10. Técnica mais usada; tratamento com tripsina (desnaturante proteico) e coloração com Giemsa Cada par de cromossomas cora segundo um padrão de bandas clara e escuras (bandas G) Coloração com quinacrina mostarda (ou outros semelhantes); observação ao microscópio de fluorescência Cromossomas coram segundo um padrão de bandas brilhantes e opacas (bandas Q = bandas G) Desnaturação térmica e salina seguida de coloração com Giemsa ou flurocromo( Acridina) Bandas escuras e claras (bandas R) estão invertidas relativamente ao bandeamento G e Q Bandeamento G Bandeamento Q Bandeamento R
  • 14. • Coloração que contém heterocromatina constitutiva ; • Partes: centrômeros e partes dos cromossomos e braços longos dos cromossomos 1,9,16 e Y. Bandeamento C Procedimentos especiais Infertilidade
  • 15. Síndrome de DiGeorge • Usado com técnicas de bandeamentos G ou R, • Estágios iniciais da mitose, prófase e pró – metáfase; • Útil principalmente para microdeleções cromossômicas - anomalias estruturais ; • Revelam mais bandas que os métodos que usam a fase Metáfase. Bandeamento de alta resolução
  • 16. Cariotipagem espectral (SKY) • Cromossomos de uma célula de uma só vez, • Cores fluorescentes; • 24 diferentes espectros fluorescentes sendo o 23 ª e 24ª para o cromossomo X e Y; • Coloração genômica total ; • Sistema de computador para análise de imagem.
  • 18. O que essas técnicas nos permitem diagnosticar? →Euploidia múltiplo exato do conjunto cromossômico (tetraploidia) →Aneuploidia qualquer outro número que não seja múltiplo do conjunto genômico (monossomia , trissomia) • Síndrome de Down (trissomia do 21) • Síndrome de Edward (trissomia do 18) • Síndrome de Patau (trissomia do 13) • Síndrome de Turner (monossomia do cromossomo X) Translocações recíprocas – troca de segmentos entre cromossomos
  • 19. Distúrbios genéticos A nível gênico Deleção Adição Inversão Transição Exames laboratoriais referentes à:
  • 20. FISH - hibridização in situ por fluorescência • Preparação de sondas específicas de DNA. • Kits pelos laboratórios de citogenética. • Preparação das sondas: → Método direto → Método indireto • Preparação dos cromossomos. • Preparação das lâminas. • Desnaturação da sonda e do DNA cromossômico → aquecimento em solução de formamida (70C).
  • 23. • Leucemia Mieloide Crônica (LMC) → Cromossomo Filadélfia FISH - Aplicações
  • 24. FISH - Aplicações • Síndrome Cri-du-chat  Microdeleção
  • 25. Detecção de aneuploidias – Trissomia do 21
  • 26. PCR Extração e purificação do DNA 1. Tampão de extração (EDTA, SDS em pH básico), 2. Adicionar Proteinase K; 3. Adicionar RNAse; 4. Adicionar Fenol; 6. Adicionar Clorofórmio/ álcool isoamílico; 8. Adicionar Acetado de Na 3M e etanol gelado.
  • 27. • DNA molde, • Primers (delimitam a sequência a ser amplificada); • DNA polimerase (Taq polimerase); • dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP); • Tampão contendo pH de ação da DNA polimerase; • Cloreto de magnésio (íons Mg2+). Componentes básicos necessários para realização de uma reação de PCR:
  • 29. Cuidados especiais nas reações de PCR • A alta sensibilidade. • Qualquer sequência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR. • Inclusão de controles em cada experimento. Possíveis fontes de contaminação da PCR Amostras biológicas Ponteiras plásticas Métodos de coleta de amostras Tubos de reagentes/vidraria Pessoal do laboratório Reagentes Ambiente do laboratório/ ar condicionado Tubos de centrífuga/ centrífuga Gelo/ nitrogênio líquido Termociclador/ banho-maria/ bloco de aquecimento Homogenizador de tecidos Transiluminador
  • 30. RT-PCR Componentes básicos para a realização de uma RT‐PCR • Transcriptase reversa, • DNA polimerase; • Taq polimerase; • dNTPs; • Primers; • Íons Mg2+. 1ª Etapa (37° C) Transcriptase reversa, DNA polimerase, primers, dNTPs 2ª Etapa (ciclos de 94°, 60°, 72° C) Taq polimerase, dNTPs, Primers, Íons Mg2+
  • 31. Eletroforese • Preparação do gel, • Aplicação da amostra no gel e separação por eletroforese.
  • 32. Procedimentos de Eletroforese Preparação do gel solidificação Tampão TBE Remover o pente Aplicar a amostraLigar a fonte Transiluminador
  • 33. Eletroforese • Estudos da relação patógeno-hospedeiro, • Determinação do peso molecular de proteínas; • Caracterização de moléculas de ácidos nucléicos; • DNA recombinante, sequenciamento de nucleotídeos; • Mapeamento de fragmentos de restrição; • Amplificação de DNA.
  • 34. Aplicações da PCR e Eletroforese de DNA → Diagnóstico pré‐natal. • Diagnóstico pré‐natal e detecção de portadores da distrofia muscular Duchenne envolvendo a triagem de deleções e duplicações usando a reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex. O paciente 1 não tem as bandas E e F, deleção dos éxons 45 ‐ 48. O paciente 2 não tem as bandas f e h e o paciente 3 não tem a banda d.
  • 35. •PCR ‐ RFLP – polimorfismo de fragmentos de restrição (Análise de mutações) Aplicações da PCR e Eletroforese de DNA → Diagnóstico de hemoglobina S (HbS). • Mutação no códon (GAG > GTG) elimina um sítio de restrição da Enzima DdeI ; assim após a digestão o alelo normal gera 3 fragmentos: 201, 88 e 87 pb e o alelo mutante 2 fragmentos: 288 e 88pb.
  • 36. Southern Blot • É um método de análise de ácidos nucleicos que permitem mapear fragmentos de DNA de interesse em uma coleção de fragmentos que é o nosso genoma. • Indicado para diagnóstico de doenças e na identificação de pessoas. • A metodologia permite a detecção de genes inteiros ou grande parte deles, assim como inserções e deleções. Doença Tipo de mutação Teste Síndrome do X frágil Expansão de trinucleotídeos (CGG) na região promotora do gene FMR1 PCR associado à Southern blot Distrofia de Becker e Duchenne Mutações do tipo deleção e duplicação no gene da distrofia (DMD). PCR e Souther blot para detecção de deleções
  • 37. Southern Blot DNA digerido por uma enzima de restrição Separação dos fragmentos em gel de agarose Transferência dos fragmentos do gel para uma membrana de nitrocelulose Membrana com os fragmentos transferidos Hibridização com sonda marcada radioativamente Autorradiografia: as bandas correspondem a fragmentos onde a sonda hibridizou
  • 38. Northern Blot • Análise do RNA, • Desnaturação antes da Eletroforese em gel com adição de formaldeído; • Depois da eletroforese o RNA é transferido para um filtro incubado com uma sonda desnaturada, marcada que hibridiza o RNA específico; • Exposição do filtro ao raio X.
  • 39. Separação dos fragmentos em gel de agarose Transferência dos fragmentos do gel para uma membrana de nitrocelulose Membrana com os fragmentos transferidos Hibridização com sonda marcada radioativamente Autorradiografia: as bandas correspondem a fragmentos onde a sonda hibridizou Purificação do RNA Northern Blot
  • 40. Dot blot Trata-se de uma metodologia que permite detectar biomoléculas. É uma simplificação da metodologia de Southern blot, northern blot e westhern blot. • Moléculas não são separadas por eletroforese, • Aplicadas diretamente a um suporte sólido como um ponto (dot); • A membrana é submetida ao processo de desnaturação é hibridizada com a sonda de interesse. Indicações Em casos em que a mutação investigada é prevalente na população investigada, ou seja, a mutação de uma base ou um pequeno número de bases é responsável por uma fração significativa de casos da doença naquela população.
  • 41. Westhern Blot Também conhecido como protein blotting ou immunoblotting, é um poderoso e importante método em biologia molecular utilizado para imunodetecção de proteínas após a separação destas por eletroforese em gel e transferência para membrana adsorvente.
  • 42. A genética médica e o futuro
  • 43. Alexandra Carvalho – Diego Meneses – Eveny Costa – Fabiana Sátiro – Felipe Rodolfo – Illy Gomes – Larissa Pessoa – Mayck Barbosa – Rosa Viana – Universidade Federal do Piauí Campus de Parnaíba Disciplina: Práticas em Biomedicina I Professora: France Keiko N. Yoshioka Biomedicina 2012-02
  • 44. Referências Bibliográficas • BAMOHAD, J. G. Genética Médica. Elsevier. 2010. capítulo 6. Citogenética Clínica: A base cromossômica da doença humana. • NASSBAUM, et al. Tompson & Tompson. Guanabara Koogan. 2002. Capítulo 9. Fundamentos de citogenética.

Notas do Editor

  1. Os profissonais biomédicos são habilitados a trabalhar na área de
  2. Patogênese Os esporos da bactéria C. tetani entra na pele por ferida ou violação, na presença de anaerobiose os esporos germinam, logo após ocorre a produção das toxinas que são liberadas após a lise celular, caindo na corrente sanguínea e vasos linfáticos chegando no SNC: agindo com o aumento da liberação do acetilcolina e inativando a proteína que regula a liberação dos neurotransmissores inibitórios da glicina e ácido gama-aminobutírico(GABA)
  3. Esse procedimento utiliza a capacidade de a nitrocelulose ligar-se fortemente ao DNA fita simples, mas não a fita dupla. O Primeiro passo é a realização de eletroforese de DNA clivado por enzimas de restrição, para alguma região de interesse que se quer identificar. O segundo passo é converter o DNA de fita dupla em fita simples quando colocado uma solução de NaOH no gel. O gel é então recoberto por uma folha de nitrocelulose e sobre esta é colocada uma pilha de papel, que por capilaridade as moléculas no gel irão se deslocarem-se para a nitrocelulose. O DNA de fita simples liga-se a membrana de nitrocelulose na mesma posição em que estava no gel. Após isso é feita a retirada da nitrocelulose e sua secagem a 80° C, que fixa o DNA permanentemente no lugar. a membrana de nitrocelulose é umedecida com uma quantidade mínima de uma solução contendo uma sonda de DNA de fita simples marcada com um isótopo radioativo. A membrana é lavada para remover a sonda radioativa não-ligada, secada, e é feita uma autoradiografia pela exposição a um filme de raio X. A posição das moléculas complementares a sonda radioativa é indicada pelo surgimento de manchas escuras no filme revelado.