O documento discute técnicas de sequenciamento de DNA e suas aplicações. Apresenta os objetivos do minicurso, o dogma central da biologia molecular, métodos de sequenciamento como o de Sanger, e plataformas atuais como Illumina, Ion Torrent, SOLiD e suas características. Inclui também estudos de caso sobre doenças genéticas e identificação criminal por DNA.

1. TÉCNICAS DE
SEQUENCIAMENTO E
APLICAÇÕES
Lucélia Silva Barroso
Bacharel em Fisioterapia – FAP
Laboratório de Microbiologia – HC – UFMG
Membro do LINC – INCT MM – FM - UFMG
ljesus@ufmg.br
Ana Paula Mendes Silva
Bacharel em Ciências Biológicas – UFV
Mestre em Genética – USP
Doutoranda em Medicina Molecular – UFMG
apmendes@ufmg.br

2. Objetivos do Minicurso
• Definir o que é sequenciamento;
• Quais as aplicações dessa técnica;
• Quais as Plataformas disponíveis;
• Diferenças metodológicas,
• Vantagens e desvantagens.
• Perspectivas futuras

3. DOGMA CENTRAL
DNA
mRNA
Proteínas
Variação Normal ou Patológica

4. Variação em seqüência Variação estrutural Variação química na cromatina
Cromatina
mRNA ncRNA
Proteínas
Epigenômica
Ambiente Variação Normal ou Patológica
Genômica
Transcritômica
Proteômica
DOGMA CENTRAL

5. Sequenciamento de DNA
• Processo de determinação da ordem precisa de
nucleotídeos na molécula de DNA, RNA e outras
moléculas;
• Determina a ordem das bases nitrogenadas:
Adenina, Guanina, Citosina, Timina e Uracila,
• Visa o entendimento do dogma central e a
previsão das moléculas possivelmente formadas a
partir de determinada sequência.

6. Objetivos para sequenciamento genômico
Exemplo
Sequenciamento
de novo
Sequenciamento
genômico
Sequenciamento de >1000 genomas de
influenza
DNA de org. extinto Homo neanderthalenses
Metagenômica Intestino humano
Resequencia-mento
Genomas completos Indivíduos humanos
Regiões genômicas Detecção de rearranjos ou regiões associados à
doenças
Mutações somáticas Em câncer
Transcriptoma mRNA Definir regulação da transcrição
Serial Analysis of Gene
Expression (SAGE)
RNAs não codificadores Identificar e quantificar microRNAs
Epigenética Padrão de Metilação Avaliar padrão de metilação em câncer

7. ESTUDO DE CASO 1

8. Esse casal de albinos poderia ter um filho com
melanina (normal)?

9. PAI MÃE
X1 X2
S1 S2 S3

10. ESTUDO DE CASO 2

11. Megaureter
Família Modelo: Pai saudável, Mãe saudável, filhos gêmeos
monozigóticos (um saudável e um doente)
 Hipótese -> Pequenas modificações no(s) gene(s) (SNPs) que possam caracterizar
o fenótipo da doença.

12. Hipótese -> Pequenas modificações no(s) gene(s) (SNPs) que possam
caracterizar o fenótipo da doença.

13. ESTUDO DE CASO 3

14. Estupro e assassinato
1985 Inglaterra
Numa pequena cidade localizada entre montanhas estava acontecendo uma
série de estupros e assassinatos de mulheres
 Qual análise inicial poderia ser feita?
 - Coleta e análise do DNA do esperma
 - Comparação entre os DNAs dos espermas de cada assassinato
• As autoridades locais simularam uma doação de sangue -> identificar o
agressor.
Todos os habitantes doaram, e apenas um deles possuía o DNA igual ao do
estuprador.
Amabis & Martho, 1995<==?

15. PLATAFORMAS
Genetic Analyser 3130

16. PCR
https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
https://www.youtube.com/watch?v=kvQWKcMdyS4

17. Gene TBX3

18. Gene LDB3

19. MÉTODO SANGER
Prêmio Nobel 1980

20. MÉTODO DE SANGER
Amplificação do fragmento alvo por PCR
Purificação do produto
Reação de Sequenciamento
Purificação do produto
Obtenção da sequência do fragmento desejado

21. MÉTODO DE SANGER
PCR
Sequenciamento

22. MÉTODO SANGER

23. MÉTODO SANGER
-MANUAL-
• DNA molde + dNTPs e ddNTPs
+ DNApolimerase + Primer
• Amplificação - PCR
• Eletroforese em gel de
acrilamida
• Os fragmentos migram
distâncias proporcionais ao
seu tamanho.
http://www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades&idcategoria=4&categoria=Atividades%20on-line&
tabela=atividades

24. MÉTODO SANGER
Reads longos (~900bps)
- Baixo Rendimento
- Alto Custo
-MANUAL-

25. MÉTODO SANGER
-AUTOMÁTICO-

26. MÉTODO SANGER
-AUTOMÁTICO-http://
www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades&idcategoria=4&categoria=Ativida
des%20on-line&tabela=atividades

27. Normalized Fluorescence Emission
(Excitation at 488 nm)
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
500 550 600 650 700
Wavelength (nm)
MÉTODO SANGER
-AUTOMÁTICO-

28. MÉTODO SANGER
-AUTOMÁTICO-

29. MÉTODO SANGER
-AUTOMÁTICO-

30. MÉTODO SANGER
-AUTOMÁTICO-

31. Genomas sequenciados (outubro/2014)
Eucariotos: 21 completes, 1701 em progresso
Procariotos: 3227completo, 25252 em progresso
Virus: 4127 completes, 94 em progresso
Organellar: 5039 completos
195

32. NATURE Vol 464 1 April 2010

33. 2001: Human Genome Project
2.7G$, 11 years
2001: Celera
100M$, 3 years
2007: 454
1M$, 3 months
2008: ABI SOLiD
60K$, 2 weeks
2009: Illumina,
Helicos
40-50K$ 2010: 5K$,
a few days?
2012: 1000$,
<24 hrs?

34. Next Gen X Sanger

35. 2ª Geração de Sequenciamento
• 454 - Pirosequenciamento (Roche)
•
•Genome Analyser - Seqüenciamento por término reversível
(Illumina-Solexa)
• SOLiD - Seqüenciamento por ligação de sondas (Applied
Biosystems - Life)

36. Pirosequenciamento – 454/Roche
• Comercializada em 2004
• Etapas:
- Ligação de adaptadores
- PCR em emulsão
- Seqüenciamento

37. Pirosequenciamento – 454/Roche

40. Pirosequenciamento – 454/Roche
*dNTP – só um deles

41. Pirosequenciamento – 454/Roche
Resultado

42. HiSeq 2000
Illumina (Solexa)
 Produz acima de 600Gb por corrida em 13 dias.
 Custo de resequenciar um genoma humano:
UNC-CH Genome Analysis Facilit - (30x cobertura)
aproximadamente $6,000
MiSeq
https://www.youtube.com/watch?v=l99aKKHcxC4
 Sistema de pequena
capacidade,
 Estudo metagenômico,
 PE 2x250cycles in 27hours.
https://www.youtube.com/watch?v=1uZtCMY-yEw

43. Sequenciamento por ligação de sondas (SOLiD)
• SOLiD = Sequencing by Oligo Ligation and Detection
• Data de comercialização = 2007
• Etapas:
1) Ligação de adaptadores
2) PCR em emulsão
3) Seqüenciamento
https://www.youtube.com/watch?v=nlvyF8bFDwM

44. Sequenciamento por ligação de sondas (SOLiD)

45. 4ª Geração de Sequenciamento
Ion Torrent (life technologies)
Tamanho do read - 200-250bp
(200cycles)
Não realiza leitura Paired End
Sequenciamento mais rápido do
mercado.
Recommendações:
 Amplicons (produtos de PCR),
 Genomas de tamanho pequeno a
médio.

46. Ion Proton System (life technologies)
Genoma humano em 1 dia
Custo de reagents por corrida - $1000
Taxa de erro em torno de 1.2%
RNAseq, ChIPseq
 Ion Proton Chip I – 10 Gb
 Ion Proton Chip II – 100 Gb

47. Plataforma Tamanho
do read
Tempo de
corrida
Gb/corrida Vantagens Desvantagens
SAGE 900 pb 1 – 2 dias 0.02 Read longo Alta taxa de erro
454 500 pb 8 horas 0.04 Read longo Alta taxa de erro
HiSeq 75-100 2 dias 600 Sequenciamento
profundo/custo
Reads pequenos
MiSeq 75 1 dia 2 Sequenciamento
profundo/custo
Reads pequenos
Solid 85 8 dias 150 Baixa taxa de
erro
Reads pequenos
Corrida longa
Ion
Torrent
200 2 horas 100 Corrida rápida Novo*
Ion Proton 200 2horas 100 Corrida rápida Novo*

50. “ Só os que se arriscam a ir
longe demais são capazes de
descobrir o quão longe se
pode ir. ”
T. S. Eliot