O documento descreve a história e técnicas da reação em cadeia da polimerase (PCR), incluindo seu desenvolvimento por Kary Mullis em 1985 e seu uso para amplificar DNA. Detalha como a PCR usa ciclos de aquecimento e resfriamento para criar cópias de DNA, e como as técnicas de eletroforese e sequenciamento, como o método de Sanger, podem identificar esses produtos de DNA. Finalmente, lista vários usos da PCR e do sequenciamento de DNA em medicina, pesquisa e outras aplicações.

1. Resumo: PCR (Polymerase Chain Reaction)
História
A PCR (Polymerase Chain Reaction – Reação em Cadeia de Polimerase). foi desenvolvida por um Kary Mullis,
bioquímico da Cetus Corporation, em 1985, seu Fred Faloona seu principal assistente. A PCR é amplifica o DNA, criando diversas
cópias a partir de um material genético inicial pelo qual se tem interesse. A primeira divulgação da PCR ocorreu na Science,
revista científica dos EUA, a respeito detecção de mutaçõesno DNA humano, no caso, células com anemia falciforme. Em 1993,
Kary Mullis foi condecorado com o prêmio Nobel de Química pelo processo da PCR.
A Técnica PCR:
O objetivo é criar, artificialmente, milhares de cópiasde um único pedaço de DNA. É necessário apenas um pedaço do DNA
desejado, primers(DNAs iniciadores), nucleotídeos (adenina, guanina, citosina e timina) e a enzima DNA polimerase (enzima
que faz replicação do DNA). Os materiais são colocados em tubos de ensaio e inseridos em uma máquina de PCR, que irá,
através de mudanças na temperatura, agilizar o processo de desnaturação e replicação.
Dideoxinucleotídeos
Os didexinucleotídeos (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), durante o processo, substituem as bases nitrogenadas A, T, C,
G, para finalizar o fragmento de DNA sendo sintetizado no momento. O que ocorre é que as bases nitrogenadas comuns tem um
OH que permite a ligação entre elas.
Identificação dos produtos das reações - Eletroforese
Define que uma fite de DNA é negativa. Quando colocados em uma solução eletrolítica com certa voltagem, os
fragmentos de DNA se deslocarão para próximo do catodo (positivo).
Para separar os fragmentos por tamanho, estes são “peneirados” por peneiras moleculares. Dependendo dos tamanhos
dos furos delas, alguns são nelas retidos, outros liberados. Quanto menor o fragmento, mais ele se desloca, então, para separ á-
los por tamanho seus deslocamentos são comparados com os de outros fragmentos de tamanho conhecido.
Sequenciamento de DNA e suas técnicas
Sequenciamento de DNA é uma técnica usada para determinar qual a sequência de nucleotídeos que compõe um DNA.
As primeiras técnicas de sequenciamento surgiram nos anos 70. Pode ser usada em ambos os ácidos nucleicos (DNA e RNA),
independente do formato em que estejam.
Sequenciamento Químico (Maxam-Gilbert)
O DNA sequenciado precisa ser marcado para servir de prova após a degradação química, por meio de um composto
químico chamado fósforo 32P, adicionado no final da cadeia. Tem como base a decomposição da molécula de DNA em pontos
específicos, causando clivagem em C, G, G+A e T+C.
Sequenciamento Enzimático (Sanger-Coulson)
Separada em duas reações: LabellingReaction e Chain TerminatingReaction.
LABELLING REACTION: DNA a ser sequenciado é marcado em sua extremidade final com o grupo radioativo 32P,
semelhante ao sequenciamento químico, produzinho uma amostra de prova.
CHAIN TERMINATING REACTION: ocorre a separação em quarto tubos com os diferentes didexinucleotídeos.
Sequenciamento Automático
Serviu para solucionar as limitações do método de Sanger-Coulson. Usa o princípio básico do sequenciamento
enzimático, mas a marcação dos trifosfatos especiais agora ocorre por fluorescência, Utiliza-se de lasers, que ao excitarem o
trifosfato especial, fazem com que eles produzam fluorescência de diferentes comprimentos de onda
Pode ser de 3 tipos:
1- Sequenciador automático de gel polimerizado de acrilamida
2- Sequenciador por eletroforese capilar: ou microcapilar
3- Sequenciamento shotgun (fragmentos aleatórios)
Usos
Medicina Forense, identificação de doenças hereditárias, construção de árvores filogenéticas, clonagem de genes, testes
de paternidade, detecção de organismos causadores de infecções, concepção de organismos transgênicos,amplificação de DNA
para processos de mutagênese, detecção de mutações, preparação de fragmentos de DNA para a clonagem, detecção de
agentes patológicos (vírus, bactérias, etc.), identificação de microorganismos, sequenciamento genético de animais extintos.