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PERFIS GENÉTICOS DE AMOSTRAS DE DNA DEGRADADO EM GENÉTICA FORENSE Autores: Abel de Castro Vieira, Diego Ramos Azevedo, Lídia Alexandre Rosa, Poliana Mendonça de Sousa
Princípio da genética forense INDENTIFICAÇÃO HUMANA POR VARIAÇÕES EM DNA; Uso de variação genética em casos forenses; 1902 -> Uso da mancha de sangue para análise; 1960 -> Análise de variação molecular através de proteínas sanguíneas; 1980 -> Método de paternidade (Apogeu);
Princípio da genética forense PCR (grande importância para genética, em especial para a forense); http://bitesizebio.com/articles/the-invention-of-pcr/
Princípio da genética forense Regiões hipervariáveis para análise;                   *Muito informativos; VNTR (Vareiblenumber tandem repeats); STR (short tandem repeats)                                                   Encontrados em                                                   locos específicos,                                                   porém, com grande                                                  polimorfismo entre                                                   cada indivíduo. http://statistics.arizona.edu/courses/EEB208-2008/Lecture08/Lecture08.html
Princípios da genética forense VNTR;  Desvantagens:     Regiões variáveis de 6pb-100pb (muito grande); Grande volume de amostra; Interpretação muito complexa; STR; Vantagens: Regiões variávei de geralmente 4pb (tetranucleotídeos); Presente em locos em todos cromossomos; Custo-benefício alto (Relativamente baratos e eficientes em um número baixo de amostra);
Princípios da genética forense  Em amostras preservadas a análise de microssatélites (STR’s) são eficientes, mas: As amostras geralmente em cenas de crimes não estão intactas (sofrem DEGRADAÇÃO); Por fatores: Químicos; Ambientais; Físicos; Tempo;
DNA degradado Situação muito comum em desastres e grandes catástrofes; 1ª alternativa  Análise de microssatélites
DNA degradado E AGORA? Quando a técnica de PCR+STR não é possível, usa-se outras saídas;
DNA degradado (SOLUÇÕES) DNA mitocondrial: Maior número de cópias nas células; Características moleculares que     garante maior estabilidade; Mais utilizada quando há forte    degradação; Porém da apenas linhagem matrilínea; http://en.wikipedia.org/wiki/File:Mitochondrial_DNA_and_diseases.png
DNA degradado (SOLUÇÕES) Mini-STR’s Marcadores adicionais usados em amostras degradadas; Primeiramente desenvolvidos pelo laboratório Bode (USA); 26 Locos de mini-STR’s(outros não foram recomendados por conta de “ALELO NULO”)           *Não amplificação da região específica devido            a mutações pontuais na região de ligação com             os primer’s.
Eletroferogramaem ALELO NULO
DNA degradado (SOLUÇÕES) PCR multiplex: Fragmentos detectáveis não são superiores a 150pb; Amplificação de regiões em que kit’s comerciais de STR’s não são adequados http://www.cstl.nist.gov/strbase/miniSTR.htm
DNA degradado (SOLUÇÕES) SNP’; Mutações pontuais Alternância mínima de 1% da população; Mais frequentes que os microssatélites (cada 300pb);   *presente em regiões codificantes e não-codificantes; Marcadores para individualização genética;
DNA degradado (SOLUÇÕES) http://www.broadinstitute.org/education/glossary/snp
DNA degradado (SOLUÇÕES) 90% da variabilidade humana vem dos SNP’s; Gera produtos de amplificação muitos menores; Cerca de 50pb;                                     Permitindo estudo de material                                     degradado (casos de cadáveres                                    em estágio avançado de decompo- sição e/ou carbnizados)
DNA degradado (SOLUÇÕES) São marcadores bi-alélicos;    Possíveis genótipos:         Ex.:  Se alelos de um Loco é A ou B, seus                  possíveis genótipos seriam: A/B ;  A/A ou B/B     * Porém, é dificil a identificação de um possível heterozigoto de uma mistura de homozigotos
DNA degradado (SOLUÇÕES) Desvantagem: Incapacidade de amplificar simultaneamente, de pequenas quantidades de DNA, SNP’s suficientes  de forma multiplex; Produz menos informação  que um marcador  STR;            Número maior de SNP para um razoável poder de             definição de um único perfil genético.
O que temos?  (KIT’S) PowerPlex® S5  São mini-STR’s; Amplificação simultanea; Co-amplificaçãoe detecção de cinco locus (quatro locus STR e amelogenina), incluindo D8S1179, D18S51, amelogenina, FGA e TH01; http://www.promega.com/products/pm/genetic-identity/powerplex-s5/
EletroferogramaPOWERPLEX S5  http://www.promega.com/products/genetic-identity/str-analysis/powerplex-s5-system/
O que temos?  (KIT’S) AmpFlSTR® MiniFiler™; Amplifica oito locus autossômicos além da amelogenina; (D13S317, D7S820, D2S1338, D21S11, D16S539, D18S51, CSF1PO e FGA)  http://marketing.appliedbiosystems.com/mk/get/FORENSIC0907_WEB_PAGE
MiniFiler™ https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603805&tab=Literature
Referências APPLIED BIOSYSTEMS. AmpFlSTR®MiniFiler™PCR Amplification Kit. USA, 2011. Disponível em https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603805&tab=Literature . Acessado em 05 de junho de 2011. BONACCORSO, N. S. Aspectos técnicos, éticos e jurídicos relacionados com a criação de bancos de dados criminais de DNA no Brasil. São Paulo, 2010. Tese (Doutorado) – Faculdade de Direito. Universidade de São Paulo.    BUTLER, John M. Forensic DNA Typing. EUA. Elservier. 2ª Ed. 2005.   BUTLER, John M. The Development of Reduced Sinze STR Amplicons as Tools for Analysis of Degraded DNA. J.ForensisSci, 2003.   FORAN, David R. Relative Degradation of Nuclear and Mitochondrial DNA: An Experimental Approach. J Forensic Sci, July 2006, Vol. 51, No.4   GOODWIN, W., Linacre A., Hadi S. An Introduction to Forensic Genetics. John Wiley & Sons, 2007.    GOODWIN, W., Linacre A., Hadi S. An Introduction to Forensic Genetics. John Wiley & Sons, 2007.    HILL, Carolyn R. et. Al. Characterization of 26 MiniSTR Loci for Improved Analysis of Degraded DNA Samples. J Forensic Sci, January 2008, Vol. 53, No. 1   MEISSNER, C.; Bruse, P.; Mueller, E.; Oehmichen, M.. A new sensitive short pentaplex (ShoP) PCR for typing of degraded DNA. Forensic Science International, 21 April 2006 PROMEGA CORPORATION. PowerPlex 16 System Technical Manual. Instructions for Use of Products DC6951 e DC6950. Outubro de 2008.  Disponível em http://www.promega.com/resources/protocols/technical-manuals/101/powerplex-s5-system-protocol/ . Acessado em 03 de junho de 2011.    SOUZA, C. J QUEIROZ, R. P, Aplicações dos marcadores moleculares baseados em DNA nas questões de identificação humana no âmbito cível e forense. 2010.

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Amostras Degradadas

  • 1. PERFIS GENÉTICOS DE AMOSTRAS DE DNA DEGRADADO EM GENÉTICA FORENSE Autores: Abel de Castro Vieira, Diego Ramos Azevedo, Lídia Alexandre Rosa, Poliana Mendonça de Sousa
  • 2. Princípio da genética forense INDENTIFICAÇÃO HUMANA POR VARIAÇÕES EM DNA; Uso de variação genética em casos forenses; 1902 -> Uso da mancha de sangue para análise; 1960 -> Análise de variação molecular através de proteínas sanguíneas; 1980 -> Método de paternidade (Apogeu);
  • 3. Princípio da genética forense PCR (grande importância para genética, em especial para a forense); http://bitesizebio.com/articles/the-invention-of-pcr/
  • 4. Princípio da genética forense Regiões hipervariáveis para análise; *Muito informativos; VNTR (Vareiblenumber tandem repeats); STR (short tandem repeats) Encontrados em locos específicos, porém, com grande polimorfismo entre cada indivíduo. http://statistics.arizona.edu/courses/EEB208-2008/Lecture08/Lecture08.html
  • 5. Princípios da genética forense VNTR; Desvantagens: Regiões variáveis de 6pb-100pb (muito grande); Grande volume de amostra; Interpretação muito complexa; STR; Vantagens: Regiões variávei de geralmente 4pb (tetranucleotídeos); Presente em locos em todos cromossomos; Custo-benefício alto (Relativamente baratos e eficientes em um número baixo de amostra);
  • 6. Princípios da genética forense Em amostras preservadas a análise de microssatélites (STR’s) são eficientes, mas: As amostras geralmente em cenas de crimes não estão intactas (sofrem DEGRADAÇÃO); Por fatores: Químicos; Ambientais; Físicos; Tempo;
  • 7. DNA degradado Situação muito comum em desastres e grandes catástrofes; 1ª alternativa Análise de microssatélites
  • 8. DNA degradado E AGORA? Quando a técnica de PCR+STR não é possível, usa-se outras saídas;
  • 9. DNA degradado (SOLUÇÕES) DNA mitocondrial: Maior número de cópias nas células; Características moleculares que garante maior estabilidade; Mais utilizada quando há forte degradação; Porém da apenas linhagem matrilínea; http://en.wikipedia.org/wiki/File:Mitochondrial_DNA_and_diseases.png
  • 10. DNA degradado (SOLUÇÕES) Mini-STR’s Marcadores adicionais usados em amostras degradadas; Primeiramente desenvolvidos pelo laboratório Bode (USA); 26 Locos de mini-STR’s(outros não foram recomendados por conta de “ALELO NULO”) *Não amplificação da região específica devido a mutações pontuais na região de ligação com os primer’s.
  • 12. DNA degradado (SOLUÇÕES) PCR multiplex: Fragmentos detectáveis não são superiores a 150pb; Amplificação de regiões em que kit’s comerciais de STR’s não são adequados http://www.cstl.nist.gov/strbase/miniSTR.htm
  • 13. DNA degradado (SOLUÇÕES) SNP’; Mutações pontuais Alternância mínima de 1% da população; Mais frequentes que os microssatélites (cada 300pb); *presente em regiões codificantes e não-codificantes; Marcadores para individualização genética;
  • 14. DNA degradado (SOLUÇÕES) http://www.broadinstitute.org/education/glossary/snp
  • 15. DNA degradado (SOLUÇÕES) 90% da variabilidade humana vem dos SNP’s; Gera produtos de amplificação muitos menores; Cerca de 50pb; Permitindo estudo de material degradado (casos de cadáveres em estágio avançado de decompo- sição e/ou carbnizados)
  • 16. DNA degradado (SOLUÇÕES) São marcadores bi-alélicos; Possíveis genótipos: Ex.: Se alelos de um Loco é A ou B, seus possíveis genótipos seriam: A/B ; A/A ou B/B * Porém, é dificil a identificação de um possível heterozigoto de uma mistura de homozigotos
  • 17. DNA degradado (SOLUÇÕES) Desvantagem: Incapacidade de amplificar simultaneamente, de pequenas quantidades de DNA, SNP’s suficientes de forma multiplex; Produz menos informação que um marcador STR; Número maior de SNP para um razoável poder de definição de um único perfil genético.
  • 18. O que temos? (KIT’S) PowerPlex® S5 São mini-STR’s; Amplificação simultanea; Co-amplificaçãoe detecção de cinco locus (quatro locus STR e amelogenina), incluindo D8S1179, D18S51, amelogenina, FGA e TH01; http://www.promega.com/products/pm/genetic-identity/powerplex-s5/
  • 19. EletroferogramaPOWERPLEX S5 http://www.promega.com/products/genetic-identity/str-analysis/powerplex-s5-system/
  • 20. O que temos? (KIT’S) AmpFlSTR® MiniFiler™; Amplifica oito locus autossômicos além da amelogenina; (D13S317, D7S820, D2S1338, D21S11, D16S539, D18S51, CSF1PO e FGA) http://marketing.appliedbiosystems.com/mk/get/FORENSIC0907_WEB_PAGE
  • 22. Referências APPLIED BIOSYSTEMS. AmpFlSTR®MiniFiler™PCR Amplification Kit. USA, 2011. Disponível em https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603805&tab=Literature . Acessado em 05 de junho de 2011. BONACCORSO, N. S. Aspectos técnicos, éticos e jurídicos relacionados com a criação de bancos de dados criminais de DNA no Brasil. São Paulo, 2010. Tese (Doutorado) – Faculdade de Direito. Universidade de São Paulo.   BUTLER, John M. Forensic DNA Typing. EUA. Elservier. 2ª Ed. 2005.   BUTLER, John M. The Development of Reduced Sinze STR Amplicons as Tools for Analysis of Degraded DNA. J.ForensisSci, 2003.   FORAN, David R. Relative Degradation of Nuclear and Mitochondrial DNA: An Experimental Approach. J Forensic Sci, July 2006, Vol. 51, No.4   GOODWIN, W., Linacre A., Hadi S. An Introduction to Forensic Genetics. John Wiley & Sons, 2007.   GOODWIN, W., Linacre A., Hadi S. An Introduction to Forensic Genetics. John Wiley & Sons, 2007.   HILL, Carolyn R. et. Al. Characterization of 26 MiniSTR Loci for Improved Analysis of Degraded DNA Samples. J Forensic Sci, January 2008, Vol. 53, No. 1   MEISSNER, C.; Bruse, P.; Mueller, E.; Oehmichen, M.. A new sensitive short pentaplex (ShoP) PCR for typing of degraded DNA. Forensic Science International, 21 April 2006 PROMEGA CORPORATION. PowerPlex 16 System Technical Manual. Instructions for Use of Products DC6951 e DC6950. Outubro de 2008. Disponível em http://www.promega.com/resources/protocols/technical-manuals/101/powerplex-s5-system-protocol/ . Acessado em 03 de junho de 2011.   SOUZA, C. J QUEIROZ, R. P, Aplicações dos marcadores moleculares baseados em DNA nas questões de identificação humana no âmbito cível e forense. 2010.