Produção de substância antagonista por Ruminococcus gnavus

CIÊNCIA EQUATORIAL ISSN 2179-9563
Artigo Original Volume 1 - Número 1 - 1º Semestre 2011
CONDIÇÕES DE PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIA ANTAGONISTA POR UMA
LINHAGEM DE Ruminococcus gnavus DA MICROBIOTA FECAL DE SERES HUMANOS
CONTRA Clostridium perfringens
Flávio Henrique Ferreira Barbosa1
; Larissa Paula Jardim de Lima Barbosa2
; Felipe Henrique Silva Bambirra3
;
Jacques Robert Nicoli4
RESUMO
A resistência à colonização pode ser o resultado da inibição de patógenos pela produção de substâncias antagonistas.
Neste, avaliou-se uma cultura de Ruminococcus gnavus, isolada da microbiota fecal dominante de um adulto sadio
quanto ao efeito antagonista resultante da produção de substância difusível frente à patógeno. Clostridium perfringens
(amostra padrão) foi utilizada como revelador do efeito antagonista. Os testes in vitro e ex vivo foram feitos pelo
método da dupla camada em meio BHI em anaerobiose. No ensaio in vivo, os níveis populacionais de C. perfringens
foram determinados nas fezes de camundongos previamente monoassociados com R. gnavus e posteriormente
desafiados por via oral com a bactéria alvo. No in vitro o antagonismo ocorreu quando tripsina foi adicionada ao meio
de cultura. No ex vivo, foi observado ao redor das fezes, halo de inibição contra C. perfringens. In vivo, foi observada
drástica redução do patógeno. Os resultados mostram que o R. gnavus é capaz de produzir substância inibitória contra
C. perfringens no trato digestivo de camundongos (ex vivo, in vivo) mas não in vitro, sem adição da tripsina. Os dados
mostraram um raro caso descrito de “colaboração” entre uma bactéria e o hospedeiro que a aloja para eliminar um alvo
patogênico.
Palavras-chave: Ruminococcus gnavus, Clostridium perfringens, bacteriocina, antagonismo, microbiota.
CONDITIONS OF ANTAGONISTIC SUBSTANCE PRODUCTION FOR A Ruminococcus
gnavus STRAIN FROM FECAL MICROBIOTA AGAINST Clostridium perfringens
ABSTRACT
Colonization resistance can be result of production of antagonistic substances. This study has been to evaluate, in vitro,
ex vivo and in vivo, the production of diffusible substance against a pathogenic target by a Ruminococcus gnavus strain
was isolated from fecal microbiota of a healthy adult. A reference strain of Clostridium perfringens was used as
indicator for the antagonistic phenomenon. Double layer diffusion assay was used for in vitro and ex vivo determination
with a inhibitory zone. In vivo assay, fecal C. perfringens levels were determined after intra-gastric challenge of this
bacterium in mice previously mono-associated with R. gnavus. In vitro, antagonism was observed only when trypsin
was added to culture medium. Inhibitory zone against C. perfringens was noted around the feces of R. gnavus mono-
associated mice. In vivo, C. perfringens was eliminated from the feces of gnotobiotic mice in about six days after the
challenge. The results showed that R. gnavus produces a bacteriocin against C. perfringens in the digestive tract of
mice, and only with addition of trypsin in vitro. This is one of the very few descriptions of “collaboration” between a
bacterium and its host to eliminate a pathogenic target.
Keywords: Ruminococcus gnavus, Clostridium perfringens, bacteriocin, antagonism, microbiota.

Ciência Equatorial, Volume 1 - Número 1 - 1º Semestre 2011 Página 2

INTRODUÇÃO
A formação da microbiota normal, com a qual
o homem convive por toda a vida, tem início
no momento do nascimento, pois, ao passar
pelo canal do parto, ele recebe os primeiros
componentes de sua microbiota. A microbiota
normal distribui-se pelas partes do corpo que
estão em contato com o meio externo, isto é,
pele e mucosas. Todavia, tanto no que se
refere à quantidade como à qualidade, a
microbiota não é uniforme. Na verdade, cada
uma das regiões habitadas possui uma
microbiota com características próprias
(TANNOCK, 1995).
Com especial atenção à microbiota intestinal,
sabe-se, que o número de bactérias neste sítio
é dez vezes maior que o número de células que
formam os nossos órgãos e tecidos, isto é, 1014
bactérias para 1013
células humanas. A
microbiota intestinal desempenha inúmeras
funções, muitas das quais somente agora
começam a ser desvendadas. Por muitos anos,
vários pesquisadores acreditavam que a
microbiota intestinal não tinha nenhuma
importância para a saúde do hospedeiro. Hoje,
já se sabe que a microbiota normal é um
complexo e dinâmico ecossistema que oferece
várias funções de interesse para o hospedeiro,
incluindo contribuição nutricional,
imunomodulação e a proteção ecológica contra
microrganismos patogênicos (SAVAGE, 1977,
ZOETENDAL et al., 2001; NICOLI; VIEIRA,
2004; KAPER; SPERANDIO, 2005).
Esta microbiota associada tem uma
complexidade espacial e temporal que difere
por nicho ecológico, idade, localização
geográfica, estado de saúde, dieta e espécie
animal do hospedeiro. A relação entre a
composição da microbiota e as funções
resultantes é muito pouco conhecida, o que
dificulta entender como os fatores
perturbadores podem interferir sobre a atuação
da microbiota em relação à saúde do
hospedeiro (MACKIE et al., 1999; DUNE,
2001; GUARNER; MALAGELADA, 2003;
KAPER; SPERANDIO, 2005).
A colonização do trato gastrointestinal por
cerca de 700-1000 espécies diferentes torna
difícil distinguir as contribuições específicas
por espécies individuais às relações
hospedeiro-microbiota e entre os próprios
microrganismos. A maioria das espécies
indígenas é anaeróbia estrita e é difícil de
cultivar, identificar e quantificar (SIMON;
GORBACH, 1984; NICOLI, 1995; MACKIE
et al., 1999; MCFARLAND, 2000; SAARELA
et al., 2002; GUARNER; MALAGELADA,
2003; NICOLI; VIEIRA, 2004).
Dentre estas relações entre os microrganismos
que ocorrem no trato gastrointestinal,
destacamos neste trabalho, aqueles os quais
são produtores de substâncias antagonistas,
como as bacteriocinas, sendo encontrados
naturalmente no trato intestinal do homem e de
animais fazendo parte da microbiota
dominantes em roedores, suínos e primatas
humanos e não-humanos. Devido ao fato da
microbiota intestinal constituir um ecossistema
altamente competitivo, a produção de
compostos antagonistas pelos seus
componentes representa uma vantagem
ecológica no controle dos níveis populacionais
de outras espécies patogênicas ou não. São
várias as evidências experimentais e clínicas,
como citado anteriormente, demonstrando a
produção de ácidos, peróxido de hidrogênio e
bacteriocinas antagônicas ao crescimento de
patógenos, por parte da microbiota residente.
Sem dúvida, essas interações e os seus
produtos contribuem para evitar um
crescimento exagerado da microbiota do
hospedeiro (SAVAGE, 1977; GOLDIN;
GORBACH, 1992; NICOLI, 1995;
MCFARLAND, 2000; KLEESSEN et al.,
2000; DUNNE, 2001; SAARELA et al., 2002;
NICOLI; VIEIRA, 2004).
Embora as substâncias antagonistas,
principalmente as bacteriocinas, sejam
extensivamente pesquisadas, parece não existir
até o momento, uma elucidação completa a
respeito do tema. Além disso, a produção
dessas substâncias antagonistas é geralmente
demonstrada e estudada in vitro, ficando a
dúvida da sua produção e papel in vivo, sob
condições das mais variadas possíveis, no


ecossistema digestivo (VOLLAARD;
CLASENER, 1994; ISOLAURI et al., 2004;
NICOLI; VIEIRA, 2004).
Diante deste fato, Ramare et al. (1993),
demonstraram em testes de antagonismo in
vitro e in vivo, que um Peptostreptococcus sp.,
não é capaz de inibir o crescimento de C.
perfringens, na ausência da tripsina secretada
pelo hospedeiro. Este acontecimento serviu
para chamar a atenção para a pesquisa da
produção de substância antagonista sob
diferentes aspectos e condições. A
caracterização da produção de substância
antagonista no trato digestivo de mamíferos é,
portanto, necessária para se poder pensar em
utilizá-la como método de eliminação de
patógenos e tratamento de infecções entéricas
(DUCLUZEAU; RAIBAUD, 1989;
KLEESSEN et al., 2000; NICOLI; VIEIRA,
2004).
As espécies do gênero Ruminococcus são
cocos Gram-positivo, anaeróbios, de tamanho
e forma variáveis, encontrados no trato
gastrintestinal e que fazem parte da microbiota
indígena do homem e de animais,
principalmente ruminantes. Possuem forma
esférica ou ovóide, com 0,5-1,2 μm de
diâmetro, são imóveis e não esporulam; têm
como temperatura ótima de crescimento 37°C.
Apesar da maior complexidade da
classificação taxonômica da maioria das
bactérias nestes últimos anos, a dos cocos
anaeróbios foi simplificada. Obtêm seus
nutrientes quebrando a celulose que vem
através do sistema digestivo do organismo do
hospedeiro. Estes organismos são também
capazes de fermentar a glicose e a xilose. São
encontrados vários estudos de microrganismos
do gênero Ruminococcus como habitantes do
rúmen do gado, dos carneiros, e das cabras.
São encontrados também em cavalos, porcos e
mamíferos selvagens (MURDOCH, 1998;
KRAUSE et al., 1998; GOMEZ et al., 2002a;
GOMEZ et al., 2002b; MARCILLE et al.,
2002; BEAUD et al., 2005).
Alguns microrganismos deste gênero possuem
a capacidade de produzir substâncias
antagonistas e bacteriocinas, algumas inclusive
já caracterizadas. Esta produção já foi
documentada extensivamente nos últimos
anos. Determinou-se uma classificação
específica não só ao gênero Ruminococcus,
mas também, a outros microrganismos
produtores de bacteriocina.
Neste trabalho objetivou-se avaliar um
Ruminococcus gnavus de origem intestinal
humano, isolado por Nicoli e Raibaud (1990),
quanto à produção in vitro, ex vivo e in vivo de
substância antagonista contra espécie não
relacionada, destacando-se a inibição de
Clostridium perfringens, responsável por
quadros de intoxicação.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais
Animais Isentos de Germes (IG)
Foram usados camundongos isentos de germes
(NIH) de 21 dias de idade, de ambos os sexos,
derivados de um núcleo de reprodução de
camundongos provenientes da Taconic
(Germantown, USA), propagados no biotério
de Gnotobiologia do Departamento de
Bioquímica e Imunologia do Instituto de
Ciências Biológicas da UFMG, mantidos em
isoladores flexíveis do tipo Trexler (Standard
Safety Equipment Company, McHenry, USA)
e manuseados de acordo com técnicas já
estabelecidas (PLEASANTS, 1974) e
adaptadas às nossas condições (SILVA, 1986).
Para os experimentos, os animais foram
mantidos em microisoladores (UNO
Roestvaststaal BV, Zevenaar, Netherland) e
receberam “ad libitum”, ração “Nuvilab”
comercializada pela Nuvital (Curitiba, PR) e
água esterilizados por calor úmido.
Manejo dos Animais
A manutenção, e o manejo dos animais nos
experimentos foram conduzidos respeitando-se
o “Guide for the care and use of laboratory
animals” – National Research Concil, Institute


of Laboratory Animal Resources, Washington,
D.C., National Academy Press, 1996.
Microrganismos
Bactéria Produtora de Substância
Antagonista
Para a realização do trabalho, foi utilizada a
linhagem bacteriana de Ruminococcus gnavus,
coco Gram-positivo, anaeróbio estrito, sendo
anteriormente catalogada como
Peptostreptococcus A2 (NICOLI; RAIBAUD,
1990). Esta linhagem foi isolada de fezes de
um ser humano adulto saudável tendo sido,
gentilmente, cedida pelo professor Pierre
Raibaud do Laboratoire d´Ecologie
Microbienne INRA, Jouy-n-Josas, França.
Este microrganismo foi submetido à análise da
sequência de rDNA 16S, realizada na Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária –
EMBRAPA (Centro Nacional de Pesquisa de
Milho e Sorgo), em Sete Lagoas, Minas
Gerais.
Bactéria Indicadora de Produção de
Substância Antagonista
Como desafio para o teste in vivo e,
reveladoras para os testes ex vivo e, in vitro,
foi utilizada a linhagem bacteriana de
Clostridium perfringens tipo A (ATCC
13124), gentilmente cedida pelo Laboratório
de Materiais de Referência, do Instituto
Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio
de Janeiro, RJ.
Manutenção das Linhagens Bacterianas
As linhagens bacterianas (Ruminococcus
gnavus e Clostridium perfringens) foram
conservadas em 0,2 mL de glicerina,
esterilizada por calor seco, com 1 mL da
cultura de 24-48 horas a 37 o
C crescidas em
caldo Brain Heart Infusion - BHI (DIFCO,
Detroit, USA), suplementado com 0,5% de
extrato de levedura, 0,1% de hemina e 0,1% de
menadiona – BHI-S (HOLDMAN et al.,
1977).
Tratamento e Desafio
Quando tratados com o R. gnavus, os animais
gnotobióticos do grupo experimental
receberam um inóculo único de 0,1 ml de
cultura (contendo 109
UFC/mL), e os do grupo
controle receberam 0,1 ml de salina
tamponada estéril, por via intra-gástrica, 5 dias
antes do desafio com o C. perfringens.
Os animais foram desafiados 5 dias após a
monoassociação com o R. gnavus recebendo
0,1 ml de cultura de C. perfringens (contendo
106
UFC/mL).
As duas culturas foram preparadas a partir de
culturas crescidas em caldo BHI-S durante 24-
48 horas, a 37 o
C, em câmara anaeróbica
(Forma Scientific Company, Marietta, USA –
N2 85%, H2 10% e CO2 5%). A técnica das
diluições sucessivas foi utilizada para
quantificar os microrganismos presentes na
cultura. Alíquotas de 0,1 mL das diluições
foram plaqueadas em superfície, com auxílio
de uma alça de Drigalski, em ágar BHI-S e
incubado por 48 horas, a 37 o
C. A quantidade
de bactérias presentes na cultura inicial foi
determinada pelo número de colônias
desenvolvidas nas placas (expresso em
Unidades Formadoras de Colônia por mililitro
– UFC/mL) multiplicadas pelo fator de
diluição.
Determinação dos Níveis Populacionais de
Ruminococcus gnavus e Clostridium
perfringens nas Diversas Porções do Trato
Gastrointestinal de Camundongos
Gnotobióticos
Antes de se iniciar os experimentos de
antagonismo, foram realizados experimentos
para demonstrar a efetiva colonização do trato
gastrintestinal dos animais gnotobióticos,
pelos microrganismos que foram utilizados
neste trabalho.
Os níveis populacionais de R. gnavus e C.
perfringens (UFC/g) foram determinados no
conteúdo lumial dos seguintes órgãos:
intestino delgado, ceco, cólon (as fezes


também foram analisadas), de camundongos
gnotobióticos após 1, 5 e 10 dias de
monoassociação. Para as colheitas os animais
foram sacrificados por deslocamento cervical e
dissecados sob condições assépticas em capela
de fluxo laminar (VECCO, SP, Brasil).
O conteúdo lumial e as fezes foram recolhidos
individualmente em tubos esterilizados onde
foram pesadas. Todas as amostras foram
submetidas a diluições decimais em salina
tamponada esterilizada. Alíquotas de 0,1 mL
das diluições decimais adequadas foram
plaqueadas em ágar BHI-S para a enumeração
das colônias bacterianas e incubadas a 37°C,
por 24-48 horas, em câmara de anaerobiose
(RODRIGUES et al., 1996).
Teste de Antagonismo in vitro
O teste denominado in vitro foi realizado em
ágar BHI-S, com adição de tripsina de
pâncreas bovino, tipo XIII (Sigma Chemical
Co., St. Louis, USA) em uma concentração de
0,25 mg/mL, à partir de microgotas (5
microlitros) de R. gnavus ativado em Caldo
BHI-S por 48 horas, à 37o
C, em anaerobiose.
As placas controle não receberam adição de
tripsina para demonstrar a ausência de halo.
Após este período, as placas foram retiradas e,
em posição invertida, em cada tampa, foi
depositado 1 mL de clorofórmio. Depois de
vinte minutos as placas foram abertas para
evaporação do clorofórmio residual. Foi
inoculado então 3,5 mL de BHI-S semi-sólido
(aquecido à 56o
C e resfriado na hora do
inóculo) adicionados de 100 µL da cultura
reveladora de C. perfringens previamente
ativada em Caldo BHI-S por 48 horas, a 37o
C,
em anaerobiose. Em seguida, as placas foram
incubadas à 37o
C, por 48 horas, em
anaerobiose. Após este período foi feita leitura
da presença ou ausência de halo de inibição e
sua medição por meio de paquímetro digital
(Mitutoyo Digimatic Caliper, Mitutoyo Sul
Americana Ltda) (MAYR-HARTING et al.,
1972; TAGG et al., 1976). Foram realizados
ao todo dois experimentos nas mesmas
condições.
Teste de Antagonismo ex vivo
O teste ex vivo foi realizado antes e após os
períodos de monoassociação com o R. gnavus
(5 dias) nos animais gnotobióticos. Os animais
foram divididos em dois grupos, sendo um
controle (receberam salina estéril – 0,1 mL) e
um experimental (monoassociado com R.
gnavus – 0,1 mL, contendo 109
UFC/mL ).
Esses animais, quando tratados receberam
inóculo por via oral-gástrica. Amostras fecais
foram retiradas, por estimulação anal, e
colocadas em placas contendo ágar BHI-S. As
placas foram então colocadas sob refrigeração
(4o
C) por 48 horas. Após este período, as
placas foram retiradas e, na posição invertida,
em cada tampa, foi depositado 1 mL de
clorofórmio. Depois de vinte minutos as placas
foram abertas para evaporação do clorofórmio
residual. Foi inoculado então 1 mL da cultura
de C. perfringens (bactéria reveladora –
diluição 1:100 da cultura contendo 106
UFC/mL), previamente ativada em Caldo
BHI-S, por 48 horas, a 37o
C, em anaerobiose.
Em seguida, as placas foram incubadas a 37o
C,
por 48 horas, em anaerobiose. Após este
período foi feita a leitura da presença ou
ausência de halo de inibição e sua medição por
meio de paquímetro digital (Mitutoyo
Digimatic Caliper) (SILVA et al., 1999).
Foram realizados ao todo dois experimentos
nas mesmas condições.
Teste de Antagonismo in vivo
O experimento com animais gnotobióticos foi
desenvolvido na tentativa de elucidar ou
demonstrar o possível mecanismo pelo qual o
R. gnavus poderia agir sobre o C. perfringens.
Neste trabalho, pesquisou-se especificamente
o antagonismo, um dos vários mecanismos
sugeridos. Para a avaliação da colonização do
trato gastrintestinal, pelo R. gnavus e pelo C.
perfringens, foram realizadas análises
microbiológicas quantitativas nas fezes frescas
dos camundongos gnotobióticos, obtidas por
estimulação anal, que foram diluídas em salina
esterilizada tamponada. As colheitas
aconteceram no 1o
, 2o
, 5o
dia (desafio), 6o
, 8o
,


10o
e 11°, tendo o experimento, cinco dias de
associação anterior ao desafio. Alíquotas de
0,1 mL das diluições decimais adequadas
foram plaqueadas em ágar BHI-S para a
contagem das colônias (37o
C por 48 horas, em
anaerobiose) (RODRIGUES et al., 1996).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O trabalho, em um primeiro momento, se
propôs a estudar as condições de produção de
substância antagonista de um
Peptostreptococcus sp., o qual foi isolado da
microbiota do trato gastrintestinal de um ser
humano adulto saudável, por Nicoli e Raibaud
(1990). Verificou-se, naquela época, que este
microrganismo tinha a capacidade de produzir
in vivo e ex vivo substância antagonista contra
espécies não relacionadas, destacando-se a
inibição de Clostridium perfringens,
responsável por quadros de intoxicação.
Este acontecimento serviu para chamar a
atenção para a pesquisa da produção de
substância antagonista sob diferentes aspectos
e condições, demonstrando ser necessária a
caracterização da produção de substância
antagonista no trato digestivo de mamíferos
para se poder pensar em utilizá-la como
método de eliminação de patógenos e
tratamento de infecções entéricas.
Embora as substâncias antagonistas,
principalmente as bacteriocinas, sejam
extensivamente pesquisadas, parece não existir
até o momento, uma elucidação completa a
respeito do tema. Além disso, a produção
dessas substâncias antagonistas é geralmente
demonstrada e estudada in vitro, ficando a
dúvida da sua produção e papel in vivo, sob
condições das mais variadas possíveis, no
ecossistema digestivo.
Determinação dos Níveis Populacionais de
Ruminococcus gnavus e Clostridium
perfringens nas Diversas Porções do Trato
Gastrointestinal de Camundongos
Gnotobióticos
Este experimento foi realizado visando
demonstrar a efetiva colonização do trato
gastrintestinal dos animais gnotobióticos,
pelos microrganismos que foram utilizados
neste trabalho. Os animais gnotobióticos
receberam culturas dos microrganismos
inoculadas pela via oral-gástrica. Os níveis
populacionais de R. gnavus e C. perfringens
(UFC/g) foram determinados no conteúdo
luminal do intestino delgado, ceco e cólon (as
fezes também foram analisadas), de
camundongos gnotobióticos após cinco dias de
monoassociação. A Figura 1 apresenta os
níveis populacionais das bactérias no conteúdo
luminal dos órgãos de camundongos
gnotobióticos citados anteriormente.
Os resultados mostram que as bactérias são
capazes de colonizar o trato digestivo dos
animais gnotobióticos. Esses níveis
populacionais não variaram ao longo dos dias,
apresentando uma colonização estável até o
final do experimento (dados não mostrados).
Os níveis populacionais foram bastante
homogêneos, porém com leve crescimento à
medida que se aproximava das porções mais
inferiores do trato intestinal nos dois grupos. A
variação foi bem menor, ou quase ausente, no
ceco e no cólon, onde, também, os níveis
populacionais foram maiores.
Um perfil populacional muito semelhante ao
nosso foi encontrado por RAMARE et al.
(1993), entretanto neste trabalho foram
utilizados ratos como animais de experimento.
É importante destacar que no grupo que
recebeu C. perfringens os animais
apresentaram sinais claros (desidratação, fezes
liquefeitas, etc.) de desenvolvimento de
doença diarréica.


Ruminococcus gnavus
0
2
4
6
8
10
12
Intestino
Delgado
Ceco Cólon Fezes
Porções analisadas
LogdeUFC/gdeconteúdo
Clostridium perfringens
0
2
4
6
8
10
12
Intestino
Delgado
Ceco Cólon Fezes
Proções analisadas
LogdeUFC/gde
conteúdo
Figura 1. Níveis populacionais de Ruminococcus
gnavus e Clostridium perfringens nas diversas porções
do trato gastrointestinal de camundongos gnotobióticos
- conteúdo luminal dos seguintes órgãos: intestino
delgado, ceco, cólon e fezes de camundongos
gnotobióticos após cinco dias de monoassociação.
Teste de Antagonismo in vitro
Como demonstrado por Nicoli e Raibaud
(1990), não foi observado antagonismo por
substância difusível do R. gnavus frente ao C.
perfringens no meio BHI-S que não recebeu
adição de tripsina. Este achado confirma a
necessidade de fatores nutricionais e/ou
fisiológicos específico para a produção de
substância inibitória, ou seja, a sua produção
parece ser do tipo “induzida”. Nas placas onde
ocorreu adição da enzima, foi constatada a
presença de halo de inibição. A Tabela 1 nos
mostra os valores médios dos diâmetros de
halos de inibição em milímetros do
antagonismo in vitro de R. gnavus,
Eubacterium lentum (microrganismo controle)
e Bacteroides vulgatus (microrganismo
controle) contra C. perfringens.
Especificamente para o R. gnavus, Ramare et
al. (1993), demonstraram que a produção de
substância antibacteriana dependia de uma
presença enzimática (Tripsina-dependente).
As atividades antagonistas observadas in vitro
são geralmente explicadas por diferentes
mecanismos: produção de ácidos orgânicos,
peróxido de hidrogênio, dióxido de carbono ou
bacteriocinas (EDENS, 2003). Contudo, a
necessidade de tripsina parece eliminar os três
primeiros.
Embora linhagens bacteriocinogênicas
possuam capacidade genética estável para
produzir uma bacteriocina, isso não acontece o
tempo todo ou sobre quaisquer condições.
Vários pesquisadores (MAYR-HARTING et
al., 1972; TAGG et al., 1976; JACK et al.,
1995; OLIVEIRA, 1997) têm demonstrado
que a produção de substâncias tipo
bacteriocina pode ser influenciada por diversos
fatores tais como a composição do meio
(concentrações de extrato de levedura,
hidrolisado de caseína, aminoácidos, íons
manganês, manitol, glicose, etc.), as condições
de incubação (temperatura e tempo de
incubação, aeração e pH do meio de cultura)
ou da linhagem alvo como indutora
(MALDONADO et al., 2004a e b). Estes
dados sugerem que a produção de bacteriocina
não é espontânea e que a cultura pode ser
induzida a produzi-la.
Neste estudo, temos a representação de um
caso muito peculiar onde, a produção de uma
substância antagonista por uma bactéria
necessita de colaboração do hospedeiro que a
aloja. A necessidade da tripsina poderia ser
explicada pela ativação de uma “pro-
bacteriocina” que se encontraria inativa até o
momento em que sua molécula fosse
fragmentada pela ação enzimática e após este
processo, os fragmentos moleculares obtidos
seriam ativos contra o microrganismo alvo.
Este tipo de “quebra” é observado no
organismo do hospedeiro como, por exemplo,
nas moléculas de pepsinogênio e da pró-
insulina.


Tabela 1. Valores médios dos diâmetros de halos de inibição em milímetros do antagonismo in vitro de R. gnavus, E.
lentum e B. vulgatus contra C. perfringens.
Microrganismo produtor Diâmetro dos halos de inibição
(BHI-S + Tripsina)
Diâmetro dos halos de
inibição (BHI)
Ruminococcus gnavus
Eubacterium lentum
Bacteroides vulgatus
20,29 ± 1,9058 *
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
* Média e Desvio padrão de 16 repetições realizadas.
Teste de Antagonismo ex vivo
O resultado do teste de inibição ex vivo de C.
perfringens por R. gnavus, mostrou que houve
produção de substância antagonista no trato
gastrintestinal dos animais monoassociados
que inibiu o crescimento do patógeno, mas não
em animais isentos de germes ou
monoassociados com microrganismos não
produtores. A Tabela 2 nos mostra os valores
dos diâmetros de halos de inibição em
milímetros do antagonismo ex vivo de R.
gnavus, E. lentum (microrganismo controle) e
B. vulgatus (microrganismo controle) contra
C. perfringens.
Estes resultados coincidem com os resultados
encontrados por Nicoli e Raibaud (1990) e por
Ramare et al. (1993). Em 10 dias de
monoassociação com o R. gnavus, observou-se
que o mesmo instalou-se em altos níveis no
trato digestivo dos animais. Este resultado está
de acordo com os achados de outros
pesquisadores na literatura que demonstraram
ser o microrganismo capaz de sobreviver à
passagem através do trato gastrointestinal,
resistindo a ações adversas como pH
estomacal, sais biliares e enzimas.
Este achado confirma, mais uma vez, a
dependência de fatores nutricionais e/ou
fisiológicos específicos para a produção de
substância inibitória, ou seja, a sua produção
parece ser do tipo “induzida”, já que não é
necessária a adição de tripsina no meio de
cultura para que o fenômeno antagônico seja
observado. Os microrganismos então devem
“fazer uso” da enzima secretada pelo animal
no ambiente do trato gastrointestinal. Como
dito anteriormente, o R. gnavus, de acordo
com Ramare et al. (1993) possui dependência
enzimática para a produção de substância
antibacteriana (Tripsina-dependente).
Tabela 2. Valores dos diâmetros de halos de inibição em milímetros do antagonismo ex vivo de R. gnavus, E. lentum e
B. vulgatus contra C. perfringens.
Status Animal Diâmetro dos halos de inibição (BHI)
Isento de germes
Monoassociado com Ruminococcus gnavus
Monoassociado com Eubacterium lentum
Monoassociado com Bacteroides vulgatus
0,00
29,48 ± 3,4283 *
0,00
0,00
* Média e Desvio padrão de 16 repetições realizadas.


Teste de Antagonismo in vivo
Neste experimento, em 10 dias de
monoassociação com o R. gnavus, observou-se
o mesmo resultado do experimento ex vivo,
com a linhagem instalando-se em altos níveis
no trato digestivo dos animais gnotobióticos e
mais uma vez, destacando-se a capacidade de
sobreviver à passagem através do trato
gastrointestinal (Ver Figura 2).
Alguns autores sugerem que microrganismos
exercem sua atividade antagonista in vivo
através da produção de bacteriocina. Isto lhes
confere uma habilidade ecológica para exercer
um papel de modulação do crescimento dos
indivíduos que compõem a microbiota
intestinal. Desta forma, a atividade antagonista
significativa exercida pela linhagem de R.
gnavus estudada no presente experimento pode
ter sido devido à produção de bacteriocina,
posteriormente pesquisada.
No experimento in vivo, como demonstrado
em outros trabalhos (NICOLI; RAIBAUD,
1990; RAMARE et al., 1993), foi observado
antagonismo bacteriano (efeito barreira) do R.
gnavus contra C. perfringens em camundongos
gnotobióticos. Foi observado desaparecimento
quase total do patógeno no sexto dia após o
desafio dos animais mostrando, então, a forte
atuação de modo benéfico do microrganismo
no trato gastrintestinal seja quanto à produção
desta substância inibitória, ou a outros fatores
como competição por sítios de adesão para a
eliminação do alvo patogênico. Após este
período os animais foram sacrificados.
NíveisPopulacionais
0
2
4
6
8
10
12
1 2 5 6 8 10 11
Tempo(dias)
LogdeUFC/gdefezes
R. gnavus
C. perfringens
Figura 2. Níveis populacionais de Ruminococcus
gnavus e C. perfringens detectados nas fezes de
camundongos gnotobióticos. Foram realizadas colheitas
de fezes para análises nos dias 1, 2, 5, 6, 8, 10 e 11. Os
animais receberam C. perfringens (desafio) no dia 5
após a monoassociação com o R. gnavus.
CONCLUSÕES
Pelos resultados obtidos e nas condições em
que foram realizados os testes, realizou-se a
avaliação de uma linhagem de Ruminococcus
gnavus quanto às condições de produção de
substância antagonista contra Clostridium
perfringens in vitro, ex vivo e in vivo em
camundongos gnotoxênicos. Pôde-se constatar
que:
- O R. gnavus, sobrevive à passagem pelo trato
gastrointestinal, alcançando níveis dominância
significativos para que possa exercer com
eficácia sua ação inibitória no trato
gastrointestinal;
- No teste in vitro, só foi observado
antagonismo por substância difusível quando a
enzima tripsina foi adicionada ao meio de
cultura, sugerindo uma “colaboração” entre a
bactéria e o hospedeiro que a aloja para
eliminar o alvo patogênico;
- No teste ex vivo, observou-se a produção de
substância inibitória difusível que inibiu o
crescimento do C. perfringens somente no
animal monoassociado com R. gnavus,
fortalecendo a suspeita anterior da existência
de “colaboração” entre a bactéria e o
hospedeiro devido à produção de uma enzima
necessária para que o microrganismo
desempenhe efeito antagonista frente ao
patógeno;
- No teste in vivo, foi observado um
desaparecimento quase total de C. perfringens
nas fezes dos animais no sexto dia após o
desafio, sendo então confirmado o
antagonismo devido à produção da substância
inibitória e outros possíveis fatores não
destacados, no ecossistema intestinal do
animal.


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_____________________________________
1 – Flávio Henrique Ferreira Barbosa, PhD
Professor Adjunto I – Ciências Farmacêuticas
Universidade Federal do Amapá – UNIFAP
flavio.barbosa@unifap.br
2 – Larissa Paula Jardim de Lima Barbosa, BSc
Bióloga / Consultora
Real Biológica Ltda
larissa@realbiologica.com.br
3 – Felipe Henrique Silva Bambirra, BSc
Fisioterapeuta – Depart. Microbiologia
Instituto de Ciências Biológicas – ICB
Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG
4 – Jacques Robert Nicoli, PhD
Professor Titular – Depart. Microbiologia
Instituto de Ciências Biológicas – ICB
Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG
jnicoli@icb.ufmg.br

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