1. ISSN 2318-4752 – Volume 6, N1, 2018
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DETERMINAÇÃO DO EFEITO DAS BACTÉRIAS LÁCTICAS (Lactobacillus spp.) NA
COLONIZAÇÃO INTESTINAL E DESAFIO POR Salmonella enterica sorovar Typhimurium EM
CAMUNDONGOS GNOTOXÊNICOS (GN) – EXAME ANATOMOPATOLÓGICO
DETERMINATION OF THE EFFECT OF LACTIC BACTERIA (Lactobacillus spp.) ON INTESTINAL COLONIZATION
AND CHALLENGE BY Salmonella enterica serovar Typhimurium IN GNOTOXENIC (GN) MICE -
ANATOMOPATHOLOGICAL EXAMINATION
FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA1; FELIPE HENRIQUE SILVA BAMBIRRA2; LEANDRO
HENRIQUE SILVA BAMBIRRA3; RUBENS ALEX DE OLIVEIRA MENEZES4
RESUMO
A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado um desafio para todos os
profissionais que trabalham com toda a cadeia produtiva alimentícia. A produção mundial de suínos cresceu e o Brasil
teve um aumento significativo nas exportações de carne suína. Para que a atividade de criação de suínos se mantenha
produtiva, com a geração de lucros, promotores de crescimento têm sido incorporados às rações, com objetivo de
melhorar o processo digestivo e o desempenho zootécnico dos animais, resultando em maior ganho de peso e redução
do número de doenças. Entretanto, nos últimos anos tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os possíveis transtornos à saúde destes animais e do homem, como
consequências desta suplementação. As alternativas disponíveis para substituição dos antimicrobianos na suinocultura
incluem a utilização de probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes fitoterápicos. Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs a avaliar a capacidade de proteção das bactérias lácticas (Lactobacillus spp.) contra um
enteropatógeno bacterianos (Salmonella enterica sorovar Typhimurium), em camundongos, verificando as lesões
histológicas promovidas nos animais. De acordo com o exame anatomopatológico, algumas amostras de microrganismos
isolados do conteúdo fecal de suínos se destacam quando o objetivo almejado é a utilização para a elaboração de
produtos probióticos que poderão ser administrados via oral para os animais, logo após o nascimento, durante o desmame
(creche) e em outras fases da cadeia produtiva. Segundo laudo histopatológico, os tratamentos com os possíveis
probióticos não alteraram a estrutura histológica das porções/órgãos analisados em animais não desafiados. Já nos
animais, após 5 dias de infecção com S. Typhimurium, verificou-se que apenas o tratamento com o probiótico 11 A - L.
reuteri não altera a estrutura histológica dos órgãos analisados em camundongos, com os mesmos se apresentando com
aspectos normais e se mostrando mais efetivo em melhorar a lesão das vísceras (baço e fígado) e de porções do trato
digestivo (cólon, ceco e íleo) induzida pela infecção.
PALAVRAS-CHAVE: Lactobacillus, bactérias lácticas, suínos, probiótico.
ABSTRACT
The production of healthy and nutritious food in large quantities has become a challenge for all professionals who work
with the entire food production chain. World swine production grew and Brazil saw a significant increase in exports. In
order for the pig breeding activity to remain productive, with the generation of profits, growth promoters have been
incorporated into the rations, with the objective of improving the digestive process and the zootechnical performance of
the animals, resulting in greater weight gain and reduced number of diseases. However, in recent years there has been
an increase in awareness about the excessive use of these products, as well as the possible health disorders of these
animals and man, as consequences of this supplementation, have become evident. The alternatives available to replace
antimicrobials in pig farming include the use of probiotics, prebiotics, symbiotics and herbal agents. Following this line of
reasoning, this work aimed to evaluate the protection capacity of lactic acid bacteria (Lactobacillus spp.) Against a bacterial
enteropathogen (Salmonella enterica serovar Typhimurium), in mice, checking the histological lesions promoted in
animals. According to the anatomopathological examination, some samples of microorganisms isolated from the faecal
content of swine stand out when the aim is to use probiotic products that can be administered orally to animals, immediately
after birth, during weaning (nursery) and in other stages of the production chain. According to histopathological report,
treatments with possible probiotics did not alter the histological structure of the portions/organs analyzed in non-challenged
animals. In animals, after 5 days of infection with S. Typhimurium, it was found that only treatment with probiotic 11 A - L.
reuteri does not alter the histological structure of the organs analyzed in mice, with them presenting normal aspects and
being more effective in improving the injury of the viscera (spleen and liver) and portions of the digestive tract (colon,
cecum and ileum) induced by infection.
KEYWORDS: Lactobacillus, lactic bacteria, swine, probiotic.
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INTRODUÇÃO
A produção de alimentos saudáveis e
nutritivos em grande quantidade tem se
tornado um desafio para todos os profissionais
que trabalham com toda a cadeia produtiva
alimentícia. Estimativas indicam que o
suprimento de alimentos necessários para
atender aos requerimentos nutricionais da
população humana durante os próximos
quarenta anos equivale à quantidade
previamente produzida ao longo de toda a
história. Para atender a esta grande demanda
de alimentos de origem animal, os
pesquisadores têm se esforçado na busca de
novas tecnologias a fim de aumentar a
eficiência e a produtividade dos animais de
criação.
A suinocultura é um dos setores
agropecuários que mais tem crescido nas
últimas décadas. A produção mundial de
suínos cresceu sistematicamente nos últimos
30 anos e o Brasil teve um aumento
significativo nas exportações de carne suína.
A este fato, associa-se um marcante aumento
no comércio e consumo de carne de suínos
em todo o mundo, sendo que sua produção
está rapidamente se expandindo em muitos
países em desenvolvimento, como o Brasil, o
que faz aumentar o rigor no manejo dos
animais e na produção da carne.
Para que a atividade de criação de
suínos se mantenha produtiva, com a geração
de lucros, muitos aditivos (incluindo
promotores de crescimento, como drogas
antimicrobianas) têm sido incorporados às
rações, com objetivo de melhorar o processo
digestivo e o desempenho zootécnico dos
animais, resultando em maior ganho de peso
e redução do número de doenças. Entretanto,
nos últimos anos tem aumentado a
conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os
possíveis transtornos à saúde destes animais
e do homem, como consequências desta
suplementação (FULLER, 1989, 1992;
FULLER & COLE, 1988; SALMINEN, 1998;
TANNOCK, 1986, 1990, 1995 e 2003).
Os antimicrobianos promotores de
crescimento podem alterar a microbiota do
trato digestivo e deprimir os mecanismos de
defesa dos animais, além de deixar resíduos
indesejáveis à saúde do homem na carne.
Além disso, a presença de concentrações
baixas de antimicrobianos pode ser
responsável pelo aumento dos fenômenos de
resistência bacteriana aos mesmos.
Recentemente, novos microrganismos
resistentes a uma ou várias drogas
antimicrobianas têm surgido e sido motivo de
preocupação para a saúde pública mundial.
Estes microrganismos modificados podem se
difundir pelo meio ambiente e estarem
presentes na carne dos animais.
Por causa destas evidências, a
ausência de microrganismos potencialmente
patogênicos e a ausência de resíduos de
produtos químicos têm se tornado os
principais indicadores de qualidade da carne
de suínos, bem como de outros alimentos.
Assim, a suinocultura brasileira precisará se
adaptar às futuras normas de comércio
internacional, pois alguns países
importadores, principalmente da União
Europeia, não mais aceitarão adquirir carne
de suínos oriunda de produtores que utilizam
antimicrobianos para aumentar os índices de
produtividade de seus plantéis (FULLER,
1989, 1992; FULLER & COLE, 1988;
SALMINEN, 1998; TANNOCK, 1986, 1990,
1995 e 2003).
Assim, tem gerado a necessidade de se
buscar alternativas que possam promover os
mesmos efeitos de produtividade
relacionados ao uso dos aditivos alimentares,
porém, sem causar as mesmas
consequências indesejáveis destes. Além
disto, ainda existem prejuízos relacionados ao
impacto econômico da retirada destas drogas
antimicrobianas da alimentação de suínos.
Isto representa aumento nos custos de
produção, sendo, principalmente, causados
por aumento no consumo de ração e no
período de ocupação dos galpões, menos
ciclos produtivos por ano, além de mais gastos
com a mão-de-obra.
As alternativas disponíveis para
substituição dos antimicrobianos na
suinocultura incluem a utilização de
probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes
fitoterápicos. Dentre estas, a utilização dos
microrganismos probióticos constitui uma
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perspectiva extremamente interessante, pois
as próprias bactérias benéficas da microbiota
intestinal dos animais poderiam ser
empregadas em substituição aos
antimicrobianos. Nestes casos, estes
microrganismos poderiam favorecer o
equilíbrio do ecossistema gastrintestinal, o
que seria refletido em melhoria da saúde e
boa produtividade. Trabalhos científicos têm
sido conduzidos tentando avaliar a eficiência
da utilização dos probióticos, em substituição
aos produtos químicos, para modular a saúde
de suínos comerciais e proporcionar um
ganho de peso adequado. Bactérias do
gênero Lactobacillus são os principais
microrganismos desejáveis encontrados em
grandes quantidades por todo o trato
gastrintestinal (TGI) de suínos, mostrando ser
fortes candidatas como probióticos para estes
animais (FULLER, 1989, 1992; FULLER &
COLE, 1988; SALMINEN, 1998; TANNOCK,
1986, 1990, 1995 e 2003).
Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs a avaliar a capacidade de
proteção das bactérias lácticas (Lactobacillus
spp.) contra um enteropatógeno bacterianos
(Salmonella enterica sorovar Typhimurium),
em camundongos, verificando as lesões
histológicas promovidas nos animais.
MATERIAL E MÉTODOS
1. Microrganismos
Características Morfo-tintoriais,
Bioquímicas e Fisiológicas dos
Microrganismos Isolados
Numa placa contendo em torno de 100
unidades formadoras de colônia (UFC), as
colônias morfologicamente diferentes e mais
significativas do ponto de vista populacional
foram repicadas, a partir do ágar MRS (Difco),
no mesmo meio. A partir de colônias, de cada
amostra, que apresentaram aspectos
morfológicos distintos foram feitos esfregaços
em lâminas para coloração pelo método de
Gram. Além disto, a partir dessas mesmas
colônias foram feitos testes de catalase em
lâmina, utilizando-se H2O2 (30%). Aqueles
que se apresentaram como Gram-positivo e
catalase negativa, sugestivos de pertencerem
ao gênero Lactobacillus, foram submetidos à
identificação, utilizando técnicas de biologia
molecular (PCR-ARDRA).
Purificação e Manutenção dos
Microrganismos Isolados
Os microrganismos isolados e
avaliados pelas características morfo-
tintoriais, bioquímicas e fisiológicas e pelo
teste respiratório foram inoculados em 5 mL
de caldo MRS (Difco), sendo em seguida
incubados em anaerobiose, à 37ºC durante 48
horas. Após o crescimento, uma alíquota de
500 µL de cada tubo foi transferida para tubo
eppendorf e adicionada de glicerol esterilizado
(50 µL), sendo, em seguida, congelados a -
18ºC e -86ºC, para posterior utilização,
quando necessário. O restante dos cultivos foi
destinado às análises baseadas em técnicas
de biologia molecular, com a finalidade de
identificação das espécies isoladas.
Ativação das culturas
Amostras de Lactobacillus spp.
isoladas a partir do TGI dos suínos (Sus scrofa
domesticus), oriundos de criação intensiva, e
pré-identificadas pelo perfil de fermentação de
carboidratos (kit API 50 CHL, BioMérieux,
Marcy l’Etoile, France), foram descongeladas
e inoculadas (200 µL) em caldo MRS (Difco).
O meio foi incubado, sob condições de
anaerobiose, a 37ºC, durante 48 horas. Após
cinco passagens em caldo, 50 µL de cada
amostra foram repicados em ágar MRS
(Difco), por três métodos diferentes: pour-
plate, espalhamento com auxílio da alça de
Drigalski e estria. Então, as placas foram
incubadas em anaerobiose, sendo mantidas a
37ºC, durante 48 horas.
Para a realização do teste a seguir,
foram escolhidos seis microrganismos entre o
grupo de doze os quais apresentaram
crescimento satisfatório em aerobiose dos
trinta e um isolados e identificados como
Lactobacillus, sendo três originados de
animais recém-desmamados (21 dias) e três
originados de animais jovens/terminados (140
dias). Estas linhagens alcançaram melhores
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resultados nos testes anteriores de
crescimento, viabilidade e manutenção
(estocagem) em função da atmosfera e do
meio de cultura a partir de vinhoto de cana-de-
açúcar suplementado com diferentes fontes
de carbono e nitrogênio. Dessa forma, os
microrganismos de interesse probiótico
escolhidos para os demais testes foram:
06 J - Lactobacillus mucosae
14 J - Lactobacillus ruminis
18 J - Lactobacillus johnsonii
08 A - Lactobacillus salivarius
11 A - Lactobacillus reuteri
13 A - Lactobacillus acidophilus
2. Animais
Animais Isentos de Germes (IG)
Foram usados camundongos isentos
de germes (NIH) de 21 dias de idade, de
ambos os sexos, derivados de um núcleo de
reprodução de camundongos provenientes da
Taconic Farms (Germantown, USA),
propagados no biotério de Gnotobiologia do
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG,
mantidos em isoladores flexíveis do tipo
Trexler (Standard Safety Equipment
Company, McHenry, USA) e manuseados de
acordo com técnicas já estabelecidas
(PLEASANTS, 1974) e adaptadas às nossas
condições (SILVA, 1986). Para os
experimentos, os animais foram mantidos em
microisoladores (UNO Roestvaststaal BV,
Zevenaar, Netherland) e receberam “ad
libitum”, ração “Nuvilab” comercializada pela
Nuvital (Curitiba, PR) e água esterilizados por
calor úmido.
Manejo dos Animais
A manutenção, e o manejo dos animais
nos experimentos foram conduzidos
respeitando-se o “Guide for the care and use
of laboratory animals” – National Research
Concil, Institute of Laboratory Animal
Resources, Washington, D.C., National
Academy Press, 1996.
3. Desenho Experimental
Os níveis populacionais bacterianos (UFG/g)
foram determinados nas fezes dos
camundongos GN controles e experimentais.
Dois grupos de camundongos GN, sendo um
grupo controle e um grupo experimental
(previamente monoassociados por dez dias
com as bactérias lácticas), com cinco ou dez
animais em cada grupo, foram inoculados
intragastricamente com 0,1 mL de uma
suspensão contendo células viáveis da
bactéria patogênica (S. Typhimurium). Ao final
de seis dias de desafio, os animais que não
apresentaram morte pela infecção foram
sacrificados por deslocamento cervical para
exames anatomopatológicos.
Análises
Durante o período de monoassociação
e após o desafio com a bactéria patogênica,
as fezes dos camundongos GN experimentais
e controles foram colhidas sob estimulação
anal. As fezes foram então pesadas e
submetidas a diluições decimais em salina
tamponada esterilizada. Alíquotas de 0,1 mL
das diluições adequadas foram semeadas em
ágar MacConkey (Difco) para enumeração de
S. Typhimurium. Para contagem das bactérias
lácticas, alíquotas de 0,1 mL foram
incorporadas em ágar MRS (Difco). A
incubação foi feita a 37ºC por 24-48 horas
para as enumerações bacterianas. A
mortalidade acumulada foi anotada durante os
experimentos.
Exame Anatomopatológico
Amostras das vísceras (baço e fígado)
e de porções do trato digestivo (cólon e íleo)
dos camundongos, controles e experimentais,
que foram sacrificados no final dos
experimentos, foram submetidos a um exame
anatomopatológico. As amostras foram
fixadas em formaldeído 4% e processadas
para a inclusão e microtomia em parafina.
Foram executados cortes de 3 a 5
micrômetros de espessura, posteriormente
corados pela Hematoxilina-Eosina (HE). Os
fragmentos das amostras codificadas foram
observados sequencialmente por uma mesma
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patologista que não teve acesso ao significado
dos códigos. As amostras foram
decodificadas somente após o laudo ter sido
emitido pela patologista.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Exame Anatomopatológico de
Animais Não-Infectados por S.
Typhimurium e Associados com
Lactobacillus spp.
Amostras das vísceras (baço e fígado)
e de porções do trato digestivo (cólon, ceco e
íleo) dos camundongos GN, controles e
experimentais, que foram sacrificados no final
dos experimentos citados anteriormente,
foram submetidos a um exame
anatomopatológico pela patologista Profa.
Dra. Denise Carmona Cara Machado do
Departamento de Patologia Geral/ICB/UFMG.
Nesta etapa, foram analisadas lâminas
histológicas dos seguintes órgãos: fígado,
íleo, cólon, ceco e baço, de camundongos
gnotobióticos não-infectados com Salmonella
enterica sorovar Typhimurium e que
receberam por via oral inóculos dos
microrganismos selecionados anteriormente
06 J - Lactobacillus mucosae; 14 J -
Lactobacillus ruminis; 18 J - Lactobacillus
johnsonii; 08 A - Lactobacillus salivarius; 11 A
- Lactobacillus reuteri; 13 A - Lactobacillus
acidophilus, ver Tabela a seguir.
Segundo laudo histopatológico, os
tratamentos com os probióticos não alteraram
a estrutura histológica do cólon. Os
fragmentos de cólon de todos os grupos
apresentaram-se com mucosa íntegra,
aspecto glandular normal, epitélio contínuo e
células caliciformes em número normal. Da
mesma forma, houve manutenção da
integridade morfológica do ceco. Em todas as
porções intestinais verificadas, as regiões da
submucosa apresentaram-se com tamanho
semelhante aos do grupo controle, ou seja,
sem edema ou infiltrado inflamatório.
Provavelmente por problemas técnicos, todos
os fragmentos de íleo foram difíceis de serem
analisados. Os tratamentos com probióticos
não modificaram a estrutura do fígado dos
camundongos. O parênquima mostrou-se
preservado, sem infiltrado inflamatório ou
sinais de degeneração hepática. O baço de
todos os grupos não infectados mostrou-se
com polpa branca e vermelha dentro dos
padrões normais de camundongos.
Determinação do Efeito das
Bactérias Lácticas na Colonização
Intestinal por S. Typhimurium em
Camundongos Gnotoxênicos (GN) –
Exame Anatomopatológico
Foram analisadas lâminas histológicas
dos seguintes órgãos: fígado, íleo, cólon, ceco
e baço, de camundongos GN (não-infectados
/ controle) e infectados com S. Typhimurium
após 5 dias. Os resultados obtidos são
mostrados na Tabela a seguir.
Verificou-se que, após 5 dias de
infecção com S. Typhimurium, a estrutura da
mucosa do cólon foi completamente alterada.
Houve destruição da mucosa, com lesão
epitelial e intenso infiltrado inflamatório
neutrofílico. A mucosa ficou levemente
preservada quando do tratamento com os
probióticos 06 J - Lactobacillus mucosae; 14 J
- Lactobacillus ruminis e 18 J - Lactobacillus
johnsonii. Os tratamentos com 11 A -
Lactobacillus reuteri e 13 A - Lactobacillus
acidophilus foram mais eficazes em melhorar
a lesão da mucosa colônica induzida pela
infecção.
Da mesma forma, apenas esses
últimos probióticos diminuíram a intensidade
do infiltrado inflamatório na mucosa e
submucosa colônica. A infecção promoveu
edema nas vilosidades do ceco e infiltrado
inflamatório predominantemente de
neutrófilos. Nenhum tratamento reduziu o
edema, porém houve uma leve redução do
infiltrado inflamatório no grupo tratado com
probiótico 11 A - L. reuteri. O íleo de
camundongos infectados, sem tratamento,
apresentou edema nas vilosidades, não
houve infiltrado inflamatório evidente. O
edema foi menor quando do tratamento com
os probióticos 06 J – L. mucosae; 18 J – L.
johnsonii; 11 A – L. reuteri e 13 A – L.
acidophilus.
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Nesse tempo de infecção, nota-se a
presença de poucos focos inflamatórios no
fígado, predominantemente de neutrófilos e
macrófagos. Apenas o tratamento com o
probiótico 11 A - L. reuteri foi capaz de reduzir
o número de focos inflamatórios no fígado. No
baço, nota-se aumento do espaço
interfolicular com presença de células
inflamatórias. Da mesma forma, os folículos
apresentaram-se levemente aumentados. O
baço de camundongos tratados com o
probiótico 11 A - L. reuteri mostrou-se com
arquitetura normal. As Figuras de número 1 a
5 com os cortes histológicos realizados nos
órgãos de camundongos, os quais receberam
inoculo do 11 A - L. reuteri, e que apresentou
melhores resultados.
Tabela 1. Exame anatomopatológico de animais não-infectados por S. Typhimurium e associados com Lactobacillus
spp.
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Figura 1. Fotomicrografia de colon de camundongo infectado com Salmonella Typhimurium não tratado (A) e tratado
com 11 A - L. reuteri (B). Notar o infiltrado inflamatório na submucosa (seta) Barra = 50 mm
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Figura 2. Fotomicrografia de ceco de camundongo infectado com Salmonella Typhimurium não tratado (A) e tratado
com probiótico 11 A - L. reuteri (B). Notar o intenso infiltrado inflamatório na mucosa (seta longa) em A e (seta curta)
edema na submucosa nos dois grupos. Barra = 50 mm
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Figura 3. Fotomicrografia de íleo de camundongo infectado com Salmonella Typhimurium não tratado (A) e tratado
com probiótico 11 A - L. reuteri (B). Notar a erosão epitelial (seta longa), edema e infiltrado inflamatório na mucosa e
submucosa (seta longa) em A. Barra = 50 mm
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Figura 4. Fotomicrografia de fígado de camundongo infectado com Salmonella Typhimurium não tratado (A) e tratado
com probiotico 11 A - L. reuteri (B). Notar focos inflamatórios no parênquima dos dois grupos experimentais (seta
longa) Barra = 25mm
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Figura 5. Fotomicrografia de baço de camundongo infectado com Salmonella Typhimurium não tratado (A) e tratado
com probiótico 11 A - L. reuteri (B). Notar a presença de células inflamatórias entre os folículos linfóides nos dois
grupos experimentais (seta longa) Barra = 50 mm
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CONCLUSÃO
De acordo com os dados obtidos,
algumas amostras de microrganismos
isolados do conteúdo fecal de suínos se
destacam quando o objetivo almejado é a
utilização para a elaboração de produtos
probióticos que poderão ser administrados via
oral para os animais, logo após o nascimento,
durante o desmame (creche) e em outras
fases da cadeia produtiva.
Em relação ao exame
anatomopatológico de animais não-infectados
por Salmonella Typhimurium, todos os
tratamentos com os candidatos a probióticos
não alteraram a estrutura histológica dos
órgãos analisados, ou seja, dentro dos
padrões normais de camundongos.
Quando se verificou a determinação do
efeito das bactérias lácticas na colonização
intestinal por S. Typhimurium em
camundongos gnotoxênicos (GN), as
amostras das vísceras (baço e fígado) e de
porções do trato digestivo (cólon, ceco e íleo)
dos camundongos GN, controles e
experimentais, que foram sacrificados no final
dos experimentos citados anteriormente,
foram submetidos a um exame
anatomopatológico. O tratamento com L.
reuteri - 11 A foi mais eficaz em melhorar a
lesão das vísceras (baço e fígado) e de
porções do trato digestivo (cólon, ceco e íleo)
induzida pela infecção.
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____________________________________
1 - Graduação em Ciências Biológicas. Professor
Adjunto do Departamento de Morfologia (DMO –
CCBS) da Universidade Federal de Sergipe - UFS,
Brasil.
E-mail: flaviobarbosaufs@gmail.com
2 - Graduação em Fisioterapia. Mestrado em
Microbiogia. Departamento de Microbiologia (ICB) da
Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG, Brasil.
3 - Graduação em Medicina Veterinária. Departamento
de Microbiologia (ICB) da Universidade Federal de
Minas Gerais - UFMG, Brasil.
4 - Graduação em Enfermagem. Professor Adjunto do
Curso de Enfermagem da Universidade Federal do
Amapá (UNIFAP), Brasil.