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  1. 1. ISSN 2318-4752 – Volume 1, N1, 2013 PROBIÓTICOS: MICRORGANISMOS BENÉFICOS PROBIOTICS: BENEFICIAL MICROORGANISMS ARIANE KATIÚSCIA DOS SANTOS MARTINS 1 ; FLAVIANO DOS SANTOS MARTINS 2 ; FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA 3 RESUMO A Organização Mundial de Saúde define probióticos como “organismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefício à saúde do hospedeiro”. Como função funcional benéfica no organismo, os probióticos tem efeito sobre o equilíbrio bacteriano intestinal: controle do colesterol e de diarréias e redução do risco de câncer. Podem ser componentes de alimentos industrializados presentes no mercado, como leites fermentados, iogurte, ou podem ser encontrados na forma de pó ou cápsulas. O interesse na utilização dos probióticos com objetivo de prevenir ou tratar doenças tem sido explorado há muitos anos. Mais recentemente têm sido descritos os mecanismos de ação dos probióticos nas doenças alérgicas e sua interação com o intestino como órgão imunológico. Assim, os probióticos devem ser cuidadosamente estudados antes de uma ampla recomendação. Esses produtos, de um modo geral, são muito seguros, uma vez que são comercializados há muitos anos como suplemento alimentar ou alimento fermentado, e não possuem efeitos colaterais no metabolismo. Evidências científicas definitivas comprovando o potencial dos probióticos na melhora da qualidade de vida de pessoas com distúrbios gastrointestinais é tema promissor e de grande expectativa científica. Palavras-chave: Probióticos, Microbiota Intestinal. ABSTRACT The World Health Organization defines probiotics as "live organisms which when administered in adequate amounts, confer health benefit on the host". How beneficial functional role in the body, probiotics have an effect on the intestinal bacterial balance: control of cholesterol and diarrhea and reducing the risk of cancer. May be components of foods on the market, such as fermented milk, yogurt, or may be found in powder form or capsules. The interest in the use of probiotics in order to prevent or treat diseases has been explored for many years. More recently they have been described mechanisms of action of probiotics in allergic diseases and their interaction with the gut as immune organ. Thus, the probiotics should be carefully studied before a comprehensive recommendation. These products generally are very safe, since they are marketed for many years as a dietary supplement or food fermented and have no side effects in metabolism. Definitive scientific evidence proving the potential of probiotics to improve the quality of life of people with gastrointestinal disorders is a subject of great expectations and promising scientific. Keywords: Probiotics, Intestinal Microbiota. 8
  2. 2. ISSN 2318-4752 – Volume 1, N1, 2013 8 1. INTRODUÇÃO 1.1 Microbiota normal: definição, composição e funções. O termo “microbiota normal” refere- se à população de microrganismos que habita a pele e as mucosas de pessoas sadias. Outros termos usados são “microflora normal”, “flora normal”, “comensais” e “microbiota indígena”. A existência de uma “microbiota viral normal” é duvidosa. A pele e as mucosas sempre albergam uma variedade de microrganismos que podem ser classificados em residentes e transitórios. A microbiota residente consiste em tipos relativamente fixos de microrganismos encontrados com regularidade em determinada área e em determinada idade; se perturbada, recompõe-se prontamente. A microbiota transitória consiste em microrganismos não-patogênicos ou potencialmente patogênicos que habitam a pele ou as mucosas por horas, dias ou semanas; esta microbiota provém do meio ambiente e não se estabelece de forma permanente na superfície. Em geral, os membros da microbiota transitória são de pouco significado enquanto a microbiota residente normal permanecer intacta. Todavia, se a microbiota residente for perturbada, os microrganismos transitórios podem colonizar e proliferar, produzindo doença (NICOLI et al., 1993). Inicialmente estéril, o trato gastrointestinal do homem é rapidamente colonizado dentro de algumas horas após o nascimento. Essa colonização bem controlada envolve muitos organismos diferentes que encontram seus próprios nichos particulares ao longo da extensão do trato gastrointestinal, de forma que diferentes grupos de microrganismos colonizam diferentes níveis do trato intestinal. Devido ao seu teor de oxigênio e acidez, o número de bactérias no estômago é limitado a 10 3 -10 4 bactérias/grama de conteúdo intestinal, e consiste, principalmente, de lactobacilos e enterococos. As bactérias do intestino delgado são anaeróbios facultativos cuja proliferação é limitada pela atividade peristáltica e cujos números, embora baixos no intestino delgado superior, aumentam ao descer do duodeno até o íleo. A maior densidade populacional microbiana do trato gastrointestinal (aproximadamente 400 diferentes linhagens de bactérias) ocorre no cólon, onde o trânsito intestinal diminuído permite que as bactérias atinjam um nível de 10 11 -10 12 microrganismos/grama de conteúdo luminal. Neste local, a microbiota bacteriana é dominada por anaeróbios estritos (Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, Pepstreptococcus e Peptococcus). Os anaeróbios facultativos são menos numerosos no cólon (NICOLI & VIEIRA, 2004). A microbiota normal associada ao trato digestivo humano, pelo seu tamanho (estimado em 10 14 células viáveis e 1,2 kg de peso totais) e atividade (metabolicamente igual à de um fígado) é considerada como um dos ecossistemas mais complexo e menos controlado que se conhece. Os diferentes componentes da microbiota gastrointestinal são presentes, num momento e sítio anatômico dados, em extratos populacionais diferentes. Como exemplo, no intestino grosso de um adulto, três níveis distintos podem ser observados: (i) a microbiota dominante (99% da população, 10 9 - 10 11 UFC/g de conteúdo) constituída somente por bactérias anaeróbias estritas (Bacteroides, Eubacterium, Fusobacterium, Peptostreptococcus, Bifidobacterium); (ii) a microbiota subdominante (0,99% da população; 10 7 - 10 8 UFC/g de conteúdo) predominantemente anaeróbia facultativa (Escherichia coli, Enterococcus faecalis e algumas vezes Lactobacillus) e (iii) a microbiota residual (0,01% da população; <10 7 UFC/g de conteúdo) contendo uma grande variedade de microrganismos procarióticos (outros gêneros de Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Veillonella) e eucarióticos (leveduras e protozoários) (BERG, 1996). Em geral, quanto mais numerosa é uma população de uma espécie bacteriana, mais estável ela é no seu nicho ecológico. Por isso, e ao nível de gêneros, as microbiotas digestivas dominantes e subdominantes permanecem relativamente constantes e estáveis no tempo e de um indivíduo para outro. Ao contrário, a microbiota residual é bastante variável de um indivíduo para outro e flutua consideravelmente ao longo do tempo no mesmo indivíduo. Contudo, apesar da aparente estabilidade em termo de gêneros, as populações bacterianas dominantes e subdominantes apresentam variações consideráveis quando são examinadas ao nível das espécies que constituem cada gênero. Assim, McCartney et al. (1996) mostraram recentemente que, em dois voluntários sadios, examinados semanalmente durante um ano, os níveis populacionais do gênero Bifidobacterium foram similares e dominantes (MCCARTNEY et al., 1996). Mas, em um dos voluntários, este gênero foi constituído, durante o período estudado, por poucas espécies sempre iguais (somente 3). Entretanto, no outro voluntário, foi observada uma biodiversidade de espécies extremamente elevada (em torno de 30) associada a uma renovação contínua das mesmas. As causas (genética, faixa etária, alimentação) dessas diferenças entre um sistema fechado, caracterizado por uma baixa biodiversidade com grande estabilidade, e um sistema aberto, apresentando uma rica biodiversidade com elevada dinâmica de renovação, não foram esclarecidas. Pelo seu tamanho, a microbiota normal associada ao trato digestivo é, muitas vezes, considerada como um órgão ou organismo atuando na superfície das mucosas do hospedeiro (BERG, 1996). É responsável por três funções importantes para saúde do hospedeiro: a resistência à 9
  3. 3. ISSN 2318-4752 – Volume 1, N1, 2013 2 colonização (inibe a multiplicação de microrganismos exógenos no local), a imunomodulação (permite uma resposta imune mais rápida e adequada durante uma agressão infecciosa) e uma contribuição nutricional (fornece vitaminas e substratos energéticos e reguladores). A microbiota associada ao trato digestivo é extremamente potente nas suas funções, mas também frágil, podendo ser perturbada por diversos fatores, entre os quais: o uso de drogas antimicrobianas, a mudança de alimentação e o estresse. No caso particular de antibioticoterapia, esses distúrbios dos equilíbrios populacionais e das funções protetoras da microbiota gastrointestinal são provavelmente responsáveis pela ocorrência de 15 a 40% dos episódios de diarréias associadas ao uso de antibióticos (DAA). Além disso, a utilização excessiva e inadequada de antibióticos é também associada com a ocorrência cada vez maior de multiresistência nos microrganismos patogênicos. Neste sentido, há uma recomendação da Organização Mundial de Saúde para o desenvolvimento de métodos alternativos a serem utilizados na prevenção e/ou no tratamento de infecções microbianas (WHO, 1994). A própria WHO recomendou, em associação à redução na utilização de antimicrobianos, a utilização da terapia de interferência microbiana (uso de probióticos). 1.2 Probióticos: definição e condições de utilização Os probióticos foram inicialmente utilizados como suplementos alimentares promotores de crescimento em animais na década de 1970. Eles foram definidos, posteriormente, como células microbianas vivas ingeridas pelo hospedeiro humano para obtenção de um efeito benéfico ao nível do ecossistema digestivo (FULLER, 1992). Durante as últimas décadas, muitos estudos têm sido conduzidos para avaliar os efeitos de microrganismos probióticos, usando diferentes fórmulas e com propósitos na prevenção ou tratamento de doenças. As finalidades da utilização desses bioterapêuticos seriam instalar, reforçar ou compensar as funções da microbiota normal do trato digestivo, quando houver uma perturbação desta (desequilíbrio). Além dos probióticos mais freqüentemente utilizados, como bactérias produtoras de ácido láctico (Lactobacillus rhamnosus GG, L. acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. casei, Bifidobacterium longum, B. lactis, Streptococcus thermophilus e E. faecium SF68) e levedura (Saccharomyces boulardii), alguns outros gêneros microbianos foram testados em ensaios experimentais e clínicos, mas em menor freqüência. Foram os casos de linhagens de Escherichia coli EMO e Nissle (FIGUEIREDO et al., 2001). Os primeiros ensaios clínicos utilizando probióticos, realmente bem controlados (duplo cegos, aleatórios com placebo), foram iniciados em 1974. Estes ensaios tiveram como finalidade tanto a prevenção quanto o tratamento de infecções essencialmente intestinais, em adultos e crianças. Assim, S. boulardii, L. rhamnosus GG, L. acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. casei, B. longum, B. lactis, S. thermophilus e E. faecium SF68 foram utilizados, com resultados positivos na maioria dos casos, na prevenção da diarréia associada ao uso de antibióticos, da diarréia infecciosa e da diarréia do viajante. Resultados positivos foram obtidos, também, no tratamento de infecção por Clostridium difficile, de diarréias relacionadas à infecção pelo vírus HIV, de diarréias agudas em crianças e adultos e das diarréias agudas causadas por Vibrio cholerae e E. coli enterotoxigênica. Contudo, em alguns relatos, os ensaios clínicos não deram os mesmos resultados positivos apesar de terem sido conduzidos em situações e com probióticos aparentemente similares (ELMER et al., 1996; NAIDU et al., 1999; PENNA et al., 2000; MARTEAU et al., 2001). Os probióticos que apresentam maior volume de informações e resultados positivos, em termo de ensaios clínicos controlados terapêuticos e profiláticos, são L. rhamnosus GG, S. boulardii e E. faecium SF68. Contudo, devemos salientar que, ensaios apresentando resultados negativos são geralmente pouco divulgados, o que pode levar a uma superestimativa dos dados apresentados acima sobre os efeitos positivos do emprego dos probióticos. 1.3 Probióticos: mecanismos de atuação Os mecanismos de ação sugeridos para explicar os efeitos benéficos dos probióticos são basicamente os mesmos atribuídos à microbiota digestiva normal para exercer suas funções (proteção ecológica, imunomodulação e contribuição nutricional). Isto é coerente com o objetivo do uso desses bioterapêuticos, a saber: compensar falhas ou reforçar a atividade do ecossistema microbiano gastrointestinal já existente. Os principais mecanismos de ação compartilhados pela microbiota normal e os probióticos são: O antagonismo pela produção de substâncias que inibem ou matam o microrganismo patogênico. Vários microrganismos produzem uma gama de substâncias que inibem o crescimento de outros microrganismos. Dentre essas substâncias, podemos citar os ácidos orgânicos, o peróxido de hidrogênio e as bacteriocinas (NARDI et al., 2005; SILVA et al., 1999; VANDENBERG, 1993). As bacteriocinas constituem um grupo heterogêneo de peptídeos ou proteínas que variam muito quanto ao seu espectro antimicrobiano, propriedades bioquímicas, mecanismo de ação e características genéticas. 10
  4. 4. ISSN 2318-4752 – Volume 1, N1, 2013 3 Competição por sítios de adesão e fonte nutricional. Muitos microrganismos utilizados como probióticos competem por sítios de adesão na superfície do epitélio intestinal e por nutrientes, inibindo, assim, a fixação e a sobrevivência de patógenos (BERNET et al., 1994; COCONNIER et al., 1998). A inibição da produção ou da ação de toxinas bacterianas. Os probióticos têm a propriedade de inibir a ação de microrganismos patogênicos, seja inibindo a produção ou a ação de toxinas produzidas pelos patógenos, impedindo, assim, a sua ação no epitélio intestinal (CZERUCKA et al., 1994; BRANDÃO et al., 1998). A imunomodulação do hospedeiro. Os probióticos podem aumentar a resistência do hospedeiro à infecção (NEUMANN et al., 1998; RODRIGUES et al., 2000). Evidências recentes sugerem que a estimulação da resposta imune, seja ela específica ou inespecífica, pode ser um outro mecanismo pelo qual os probióticos protegem contra desordens intestinais (KAILA et al., 1992; MATSUZAKI & CHIN, 2000; PERDIGON et al., 1995). O primeiro mecanismo (antagonismo) é um dos mais citados e aparentemente o mais provável para explicar o efeito benéfico dos probióticos. Inúmeros trabalhos demonstraram essa capacidade in vitro, mas não existe praticamente nenhum relato deste fenômeno ocorrer no ambiente gastrointestinal. O animal gnotobiótico (sem germes ou associado com germes conhecidos) permite observar e estudar in vivo o comportamento isolado de microrganismos e suas inter-relações no ecossistema digestivo (VIEIRA & NICOLI, 1990). Este modelo animal permitiu, por exemplo, isolar e demonstrar o efeito inibitório extremamente potente contra bactérias enteropatogênicas de componentes bacterianos da microbiota fecal humana, tanto isoladamente (NICOLI et al., 1992; RAMARE et al., 1993; SILVA et al., 2001) como em associação (NICOLI & RAIBAUD, 1993). Experimentos do mesmo tipo foram feitos para observar se diversos probióticos em estudo ou já comercializados eram capazes de produzir efeitos antagonistas similares no trato digestivo de roedores gnotobióticos desafiados com várias bactérias enteropatogênicas. Para os bioterapêuticos S. boulardii (MERCK S.A.) (RODRIGUES et al., 1996), Lactobacillus delbrueckii H2B20 (UFV) (MOURA et al., 2001), B. lactis Bb12 (Christian Hansen Lab.) (SILVA et al., 1999) e E. coli EMO (INRA) (LIMA FILHO et al., 2000) nunca foi observado in vivo antagonismo contra os alvos patogênicos Salmonella enterica sorovar Typhimurium, Shigella flexneri e E. coli enteropatogênica. Contudo, em todos os casos foi notado um efeito protetor dos probióticos utilizados durante o desafio patogênico como demonstrado por dados de mortalidade e de exame histopatológico. Esses fatos sugerem que outros mecanismos devem explicar o efeito protetor dos probióticos testados como a imunomodulação (NEUMANN et al., 1998; PODOPRIGORA et al., 1999; RODRIGUES et al., 2000), a inibição da ação de toxinas (CZERUCKA et al., 1994; BRANDÃO et al., 1998) ou a competição por nutrientes ou sítios de adesão. 1.4 Probióticos: forma de utilização A ingestão dos probióticos é feita na forma de preparações farmacêuticas (cápsula, sachê) ou de alimentos (fermentados como iogurte ou leite “acidofilus” ou suplementado como o leite em pó adicionado de células vivas). Não são conhecidos probióticos capazes de se instalarem no ecossistema digestivo mesmo após uma ingestão prolongada já que a microbiota local, mesmo perturbada, impede essa colonização. Contudo, diversos bioterapêuticos sobrevivem durante a sua passagem intestinal como no caso de bactérias dos gêneros Lactobacillus, (NEUMANN et al., 1998), Streptococcus, Enterococcus (ELMER et al., 1996) e Bifidobacterium (SILVA et al., 1999) e de leveduras como S. boulardii (RODRIGUES et al., 1996; RODRIGUES et al., 2000). Mas a sobrevida não é o único fator importante para a atuação de um probiótico. Os níveis populacionais do bioterapêutico devem ser suficientemente elevados para ter um impacto no local onde se espera que ele desenvolva a sua função. Em ecologia microbiana, considera-se que um microrganismo poderá agir no ecossistema onde ele se encontra somente quando em população igual ou superior a 10 7 células viáveis/g do conteúdo (caso das microbiotas dominantes e subdominantes, como citado acima). A concentração em células viáveis do probiótico deve ser, portanto, ajustada na preparação inicial levando-se em conta a capacidade de sobrevida do microrganismo sem se multiplicar no tudo digestivo e o efeito de diluição intestinal de maneira a atingir no mínimo 10 7 células/g do conteúdo intestinal. 1.5 CONSIDERAÇÕES FINAIS Considera-se, portanto, que a concentração em células vivas do probiótico no produto a ser ingerido deve estar pelo menos de 10 8 a 10 9 UFC/g. A ingestão diária de um probiótico em quantidade adequada é, portanto, indispensável para manter níveis artificialmente elevados do microrganismo no ecossistema digestivo permitindo que ele desenvolva o efeito benéfico desejado. Além de um número adequado de células viáveis no produto original e da capacidade de sobreviver no trato digestivo, uma preparação probiótica deve apresentar um tempo longo de sobrevida nas condições de armazenamento até a sua comercialização. Existem diversas possibilidades para a forma de conservação de probióticos assim 11
  5. 5. ISSN 2318-4752 – Volume 1, N1, 2013 4 como diversos tipos de condições de armazenamento, cada um com eficiência diferenciada de manutenção da viabilidade. A liofilização é um dos métodos mais eficientes para manter a viabilidade de células microbianas durante longo período de tempo, mas em temperatura ambiente. Já a conservação na forma de suspensão aquosa de forma vegetativa leva a uma morte rápida do microrganismo, mesmo sob temperatura de refrigeração. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BERG, R.D. The indigenous gastrointestinal microflora. Trends in Microbiology, v.4, p.430-435, 1996. BERNET, M.F.; BRASSART, D.; NEESER, J.R.; SERVIN, A.L. Lactobacillus acidophilus LA1 binds to human intestinal cell lines and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent bacteria. Gut, v.35, p.483-489, 1994. BIOURGE, V.; VALLET, C.; LEVESQUE, A.; SERGHERAERT, R.; CHEVALIER, S.; ROBERTON, J.L. The use of probiotics in the diet of dogs. The Journal of Nutrition, v.128, p.2730S- 2732S, 1998 in HONG, H.A.; DUC, L.; CUTTING, S.M. The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS Microbiology Reviews, v.4, p.813- 835, 2004. BRANDÃO, R.L.; CASTRO, I.M.; BAMBIRRA, E.A.; AMARAL, S.C.; FIETTO, L.O.; TROPIA, M.J.M.; NEVES, M.J.; SANTOS, R.G.; GOMES, N.C.M.; NICOLI, J.R. Intracellular signal triggered by cholera toxin in Saccharomyces boulardii and Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, v.64, p.564-568, 1998. CANGANELLA, F.; PAGANINI, S.; OVIDI, M.; VETTRAINO, A.M.; BEVILACQUA, L.; MASSA, S.; TROVATELLI, L.D. A microbiological investigation on probiotic pharmaceutical products used for human health. Microbiol. Res., v. 152, p. 171-179, 1997. Clinical and laboratory Standards Institute (CLSI). 2005. CZERUCKA, D.; ROUX, I.; RAMPAL P. Saccharomyces boulardii inhibits secretagogue- mediated adenosine 3’,5’-cyclic monophosphate induction in intestinal cells. Gastroenterology, v.106, p.65-72, 1994. ELMER, G.W.; SURAWICZ, C.M.; MCFARLAND, L.V. Biotherapeutic agents. A neglected modality for the treatment and prevention of selected intestinal and vaginal infections. Journal of the American Medical Association, v.275, p.870-876, 1996. FIGUEIREDO, P.P.; VIEIRA, E.C.; NICOLI, J.R.; NARDI, R.D.; RAIBAUD, P.; DUVAL-IFLAH Y.; PENNA, F.J. Influence of oral inoculation with Escherichia coli EMO on the frequency of diarrhea during the first year of life in human newborns. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, v.33, p.70-74, 2001. FRANCO, B.D.G.M; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos, Atheneu, 182p., 2002. FULLER, R. Probiotics: the scientific basis. London: Chapman & Hall, 398p., 1992. GILLILAND, S.E.; SPECK, M.L. Enumeration and identity of lactobacilli in dietary products. J. Food Prot., v. 40, p. 760-762, 1977. GRAFF, J.; BRINCH, K.; MADSEN, J.L. Gastrointestinal mean transit times in young and middle-aged healthy subjects. Clinical Physiology, v.21, p.253-259, 2001 in HONG, H.A.; DUC, L.; CUTTING, S.M. The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS Microbiology Reviews, v.4, p.813-835, 2004. HAMILTON-MILLER, J.M.; GIBSON, G.R. Efficacy studies of probiotics: a call for guidelines. Br. J. Nutr., v. 82, p. 73-75, 1999. HAMILTON-MILLER, J.M.; SHAH, S. Deficiencies in microbiological quality and labelling of probiotic supplements. Int. J. Food Microbiol., v. 72, p. 175- 176, 2002. HAMILTON-MILLER, J.M.; SHAH, S.; WINKLER, J.T. Public health issues arising from microbiological and labelling quality of foods and supplements containing probiotic microorganisms. Public Health Nutr., v. 2, p. 223-229, 1999. HONG, H.A.; DUC, L.; CUTTING, S.M. The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS Microbiology Reviews, v.4, p.813-835, 2004. HUGHES, V.L.; HILLIER, S.L. Microbiologic characteristics of Lactobacillus products used for colonization of the vagina. Obstet. Gynecol., v. 75, p. 244-248, 1990. INNOKA, S.; UEHARA, S.; KIMURA, M. The effect of Bacillus natto on the T and B lymphocytes from spleens of feeding chickens. Poultry Science, v.65, p.1217-1219, 1986 in HONG, H.A.; DUC, L.; CUTTING, S.M. The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS Microbiology Reviews, v.4, p.813-835, 2004. 12
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