Este documento descreve um estudo que determinou os níveis populacionais de Lactobacillus reuteri isolado de suínos em diferentes partes do trato gastrointestinal de camundongos gnotobióticos. O L. reuteri mostrou capacidade de colonizar o trato gastrointestinal dos camundongos e alcançar níveis adequados de proteção nas diversas porções estudadas. Espera-se que este microrganismo possa ser usado como probiótico para suínos, substituindo parcialmente os promotores de crescimento antimicrobianos atualmente util

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DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS POPULACIONAIS DE UM Lactobacillus reuteri,
ISOLADO DE SUÍNO ADULTO NAS DIVERSAS PORÇÕES DO TRATO
GASTROINTESTINAL DE CAMUNDONGOS GNOTOBIÓTICOS (GN) COM
POTENCIAL PARA USO PROBIÓTICO
DETERMINATION OF THE POPULATION LEVELS OF A Lactobacillus reuteri, ISOLATED FROM
ADULT SWINE IN THE DIFFERENT PORTIONS OF THE GASTROINTESTINAL TRACT OF
GNOTOBIOTIC (GN) MICE WITH POTENTIAL FOR PROBIOTIC USE
FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA1; FELIPE HENRIQUE SILVA BAMBIRRA2; LEANDRO
HENRIQUE SILVA BAMBIRRA3; RUBENS ALEX DE OLIVEIRA MENEZES4
RESUMO
A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado um desafio para todos os
profissionais que trabalham com toda a cadeia produtiva alimentícia. A produção mundial de suínos cresceu e o Brasil
teve um aumento significativo nas exportações de carne suína. Para que a atividade de criação de suínos se mantenha
produtiva, com a geração de lucros, promotores de crescimento têm sido incorporados às rações, com objetivo de
melhorar o processo digestivo e o desempenho zootécnico dos animais, resultando em maior ganho de peso e redução
do número de doenças. Entretanto, nos últimos anos tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os possíveis transtornos à saúde destes animais e do homem, como
consequências desta suplementação. As alternativas disponíveis para substituição dos antimicrobianos na suinocultura
incluem a utilização de probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes fitoterápicos. Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs determinar os níveis populacionais de um Lactobacillus reuteri, isolado de suíno adulto nas diversas
porções do trato gastrointestinal de camundongos gnotobióticos (GN) com potencial para uso probiótico. Conclui-se, até
este momento, que este microrganismo possui capacidade de colonização do trato gastrointestinal de camundongos
gnotobióticos e que alcança níveis adequados à proteção nas diversas porções estudadas. Espera-se, que L. reuteri 11
A, possa ser utilizado para a elaboração de probiótico para suínos, visando substituir, mesmo que parcialmente, os
promotores de crescimento antimicrobianos, atualmente empregados nesta atividade produtiva. Porém, para que tal
probiótico possa vir a ser aprovado, são necessários ensaios demonstrando seus efeitos in vivo, além de uma avaliação
de seu impacto no crescimento e ganho de peso dos suínos.
PALAVRAS-CHAVE: Lactobacillus, bactérias lácticas, suínos, probiótico.
ABSTRACT
The production of healthy and nutritious food in large quantities has become a challenge for all professionals who work
with the entire food production chain. World swine production grew and Brazil saw a significant increase in exports. In
order for the pig breeding activity to remain productive, with the generation of profits, growth promoters have been
incorporated into the rations, with the objective of improving the digestive process and the zootechnical performance of
the animals, resulting in greater weight gain and reduced number of diseases. However, in recent years there has been
an increase in awareness about the excessive use of these products, as well as the possible health disorders of these
animals and man, as consequences of this supplementation, have become evident. The alternatives available to replace
antimicrobials in pig farming include the use of probiotics, prebiotics, symbiotics and herbal agents. Following this line of
reasoning, this work aimed to determine the population levels of a Lactobacillus reuteri, isolated from adult pigs in the
different portions of the gastrointestinal tract of gnotobiotic (GN) mice with potential for probiotic use. It is concluded, until
now, that this microorganism has the capacity to colonize the gastrointestinal tract of gnotobiotic mice and that it reaches
levels suitable for protection in the various portions studied. It is hoped that L. reuteri 11 A can be used for the preparation
of probiotics for swine, aiming to replace, even partially, the antimicrobial growth promoters currently employed in this
productive activity. However, for such a probiotic to be approved, tests are required demonstrating its effects in vivo, in
addition to an evaluation of its impact on the growth and weight gain of swine.
KEYWORDS: Lactobacillus, lactic bacteria, swine, probiotic.

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INTRODUÇÃO
A produção de alimentos saudáveis e
nutritivos em grande quantidade tem se
tornado um desafio para todos os profissionais
que trabalham com toda a cadeia produtiva
alimentícia. Estimativas indicam que o
suprimento de alimentos necessários para
atender aos requerimentos nutricionais da
população humana durante os próximos
quarenta anos equivale à quantidade
previamente produzida ao longo de toda a
história. Para atender a esta grande demanda
de alimentos de origem animal, os
pesquisadores têm se esforçado na busca de
novas tecnologias a fim de aumentar a
eficiência e a produtividade dos animais de
criação.
A suinocultura é um dos setores
agropecuários que mais tem crescido nas
últimas décadas. Segundo dados da
EMBRAPA, a produção de carne suína no
Brasil vem crescendo mais 5% ao ano desde
o ano de 2006. A produção mundial de suínos
cresceu sistematicamente nos últimos 30
anos e o Brasil teve um aumento significativo
nas exportações de carne suína, chegando à
quarta colocação mundial e, atualmente, esse
produto pode ser encontrado até na Rússia. A
este fato, associa-se um marcante aumento
no comércio e consumo de carne de suínos
em todo o mundo, sendo que sua produção
está rapidamente se expandindo em muitos
países em desenvolvimento, como o Brasil, o
que faz aumentar o rigor no manejo dos
animais e na produção da carne.
Para que a atividade de criação de
suínos se mantenha produtiva, com a geração
de lucros, muitos aditivos (incluindo
promotores de crescimento, como drogas
antimicrobianas) têm sido incorporados às
rações, com objetivo de melhorar o processo
digestivo e o desempenho zootécnico dos
animais, resultando em maior ganho de peso
e redução do número de doenças. Entretanto,
nos últimos anos tem aumentado a
conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os
possíveis transtornos à saúde destes animais
e do homem, como consequências desta
suplementação (FULLER, 1989, 1992;
FULLER & COLE, 1988; SALMINEN, 1998;
TANNOCK, 1986, 1990, 1995 e 2003).
Os antimicrobianos promotores de
crescimento podem alterar a microbiota do
trato digestivo e deprimir os mecanismos de
defesa dos animais, além de deixar resíduos
indesejáveis à saúde do homem na carne.
Além disso, a presença de concentrações
baixas de antimicrobianos pode ser
responsável pelo aumento dos fenômenos de
resistência bacteriana aos mesmos.
Recentemente, novos microrganismos
resistentes a uma ou várias drogas
antimicrobianas têm surgido e sido motivo de
preocupação para a saúde pública mundial.
Estes microrganismos modificados podem se
difundir pelo meio ambiente e estarem
presentes na carne dos animais.
Por causa destas evidências, a
ausência de microrganismos potencialmente
patogênicos e a ausência de resíduos de
produtos químicos têm se tornado os
principais indicadores de qualidade da carne
de suínos, bem como de outros alimentos.
Assim, a suinocultura brasileira precisará se
adaptar às futuras normas de comércio
internacional, pois alguns países
importadores, principalmente da União
Europeia, não mais aceitarão adquirir carne
de suínos oriunda de produtores que utilizam
antimicrobianos para aumentar os índices de
produtividade de seus plantéis (FULLER,
1989, 1992; FULLER & COLE, 1988;
SALMINEN, 1998; TANNOCK, 1986, 1990,
1995 e 2003).
Assim, tem gerado a necessidade de se
buscar alternativas que possam promover os
mesmos efeitos de produtividade
relacionados ao uso dos aditivos alimentares,
porém, sem causar as mesmas
consequências indesejáveis destes. Além
disto, ainda existem prejuízos relacionados ao
impacto econômico da retirada destas drogas
antimicrobianas da alimentação de suínos.
Isto representa aumento nos custos de
produção, sendo, principalmente, causados
por aumento no consumo de ração e no
período de ocupação dos galpões, menos
ciclos produtivos por ano, além de mais gastos
com a mão-de-obra.

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As alternativas disponíveis para
substituição dos antimicrobianos na
suinocultura incluem a utilização de
probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes
fitoterápicos. Dentre estas, a utilização dos
microrganismos probióticos constitui uma
perspectiva extremamente interessante, pois
as próprias bactérias benéficas da microbiota
intestinal dos animais poderiam ser
empregadas em substituição aos
antimicrobianos. Nestes casos, estes
microrganismos poderiam favorecer o
equilíbrio do ecossistema gastrintestinal, o
que seria refletido em melhoria da saúde e
boa produtividade. Trabalhos científicos têm
sido conduzidos tentando avaliar a eficiência
da utilização dos probióticos, em substituição
aos produtos químicos, para modular a saúde
de suínos comerciais e proporcionar um
ganho de peso adequado. Bactérias do
gênero Lactobacillus são os principais
microrganismos desejáveis encontrados em
grandes quantidades por todo o trato
gastrintestinal (TGI) de suínos, mostrando ser
fortes candidatas como probióticos para estes
animais (FULLER, 1989, 1992; FULLER &
COLE, 1988; SALMINEN, 1998; TANNOCK,
1986, 1990, 1995 e 2003).
Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs determinar os níveis
populacionais de um Lactobacillus reuteri,
isolado de suíno adulto nas diversas porções
do trato gastrointestinal de camundongos
gnotobióticos (GN) com potencial para uso
probiótico.
MATERIAL E MÉTODOS
1. Microrganismos
Características Morfo-tintoriais,
Bioquímicas e Fisiológicas dos
Microrganismos Isolados
Numa placa contendo em torno de 100
unidades formadoras de colônia (UFC), as
colônias morfologicamente diferentes e mais
significativas do ponto de vista populacional
foram repicadas, a partir do ágar MRS (Difco),
no mesmo meio. A partir de colônias, de cada
amostra, que apresentaram aspectos
morfológicos distintos foram feitos esfregaços
em lâminas para coloração pelo método de
Gram. Além disto, a partir dessas mesmas
colônias foram feitos testes de catalase em
lâmina, utilizando-se H2O2 (30%). Aqueles
que se apresentaram como Gram-positivo e
catalase negativa, sugestivos de pertencerem
ao gênero Lactobacillus, foram submetidos à
identificação, utilizando técnicas de biologia
molecular (PCR-ARDRA).
Purificação e Manutenção dos
Microrganismos Isolados
Os microrganismos isolados e
avaliados pelas características morfo-
tintoriais, bioquímicas e fisiológicas e pelo
teste respiratório foram inoculados em 5 mL
de caldo MRS (Difco), sendo em seguida
incubados em anaerobiose, à 37ºC durante 48
horas. Após o crescimento, uma alíquota de
500 µL de cada tubo foi transferida para tubo
eppendorf e adicionada de glicerol esterilizado
(50 µL), sendo, em seguida, congelados a -
18ºC e -86ºC, para posterior utilização,
quando necessário. O restante dos cultivos foi
destinado às análises baseadas em técnicas
de biologia molecular, com a finalidade de
identificação das espécies isoladas.
Ativação das culturas
Amostras de Lactobacillus spp.
isoladas a partir do TGI dos suínos (Sus scrofa
domesticus), oriundos de criação intensiva, e
pré-identificadas pelo perfil de fermentação de
carboidratos (kit API 50 CHL, BioMérieux,
Marcy l’Etoile, France), foram descongeladas
e inoculadas (200 µL) em caldo MRS (Difco).
O meio foi incubado, sob condições de
anaerobiose, a 37ºC, durante 48 horas. Após
cinco passagens em caldo, 50 µL de cada
amostra foram repicados em ágar MRS
(Difco), por três métodos diferentes: pour-
plate, espalhamento com auxílio da alça de
Drigalski e estria. Então, as placas foram
incubadas em anaerobiose, sendo mantidas a
37ºC, durante 48 horas.
Para a realização do teste a seguir, foi
escolhido o microrganismo entre o grupo de

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doze os quais apresentaram crescimento
satisfatório em aerobiose dos trinta e um
isolados e identificados como Lactobacillus,
sendo três originados de animais recém-
desmamados (21 dias) e três originados de
animais jovens/terminados (140 dias). Sendo
assim, a amostra L. reuteri - 11 A, foi a
escolhida para a realização dos testes in vivo,
tanto em camundongos por apresentar as
seguintes características relacionadas nos
itens abaixo:
- Apresentar menor sensibilidade ao
cultivo em vinhoto, conseguindo manter-se
viável e em concentrações mais elevadas por
maior tempo.
- Quando foi verificado o seu
crescimento, este microrganismo se
apresentou com boa capacidade de
multiplicação no vinhoto, destacando a
necessidade do incremento de nutrientes para
potencializar este resultado.
- Nas avaliações de adesão da
superfície celular o microrganismo
demonstrou possuir maiores probabilidades
de se fixar ao epitélio intestinal e maior
resistência à acidez.
- Em relação ao antagonismo in vitro, o
mesmo demonstrou-se eficaz contra os
microrganismos reveladores, tanto patógenos
como contra espécie relacionada
(Lactobacillus acidophilus), sugerindo a
produção de substâncias antagonista além do
antagonismo proveniente da produção de
ácidos.
- Mostrou-se bom colonizador do TGI
de camundongos, sendo que a colonização se
manteve estável por todo o período analisado.
- Não altera a estrutura histológica dos
órgãos analisados em camundongos, com os
mesmos se apresentando com aspectos
normais e se mostrando mais efetivo em
melhorar a lesão das vísceras (baço e fígado)
e de porções do trato digestivo (cólon, ceco e
íleo) induzida pela infecção.
Conclui-se, até este momento, que este
microrganismo poderia ser utilizado para a
elaboração de probiótico para suínos, visando
substituir, mesmo que parcialmente, os
promotores de crescimento antimicrobianos,
atualmente empregados nesta atividade
produtiva. Porém, para que tal probiótico
possa vir a ser aprovado, são necessários
ensaios demonstrando seus efeitos in vivo,
além de uma avaliação de seu impacto no
crescimento e ganho de peso dos suínos.
2. Animais
Animais Isentos de Germes (IG)
Foram usados camundongos isentos
de germes (NIH) de 21 dias de idade, de
ambos os sexos, derivados de um núcleo de
reprodução de camundongos provenientes da
Taconic Farms (Germantown, USA),
propagados no biotério de Gnotobiologia do
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG,
mantidos em isoladores flexíveis do tipo
Trexler (Standard Safety Equipment
Company, McHenry, USA) e manuseados de
acordo com técnicas já estabelecidas
(PLEASANTS, 1974) e adaptadas às nossas
condições (SILVA, 1986). Para os
experimentos, os animais foram mantidos em
microisoladores (UNO Roestvaststaal BV,
Zevenaar, Netherland) e receberam “ad
libitum”, ração “Nuvilab” comercializada pela
Nuvital (Curitiba, PR) e água esterilizados por
calor úmido.
Manejo dos Animais
A manutenção, e o manejo dos animais
nos experimentos foram conduzidos
respeitando-se o “Guide for the care and use
of laboratory animals” – National Research
Concil, Institute of Laboratory Animal
Resources, Washington, D.C., National
Academy Press, 1996.
3. Determinação dos Níveis
Populacionais da Bactéria Láctica
Selecionada (Lactobacillus reuteri 11 A)
nas Diversas Porções do Trato
Gastrointestinal de Camundongos
Gnotobióticos (GN)
Desenho Experimental
Os níveis populacionais do
Lactobacillus reuteri - 11 A foram

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determinados no conteúdo luminal dos
animais GN. Após dez dias de tratamento ou
monoassociação com os microrganismos, os
animais dos grupos GN foram sacrificados por
deslocamento cervical e dissecados sob
condições assépticas em uma capela de fluxo
laminar (VECCO, Campinas, SP). Os níveis
populacionais da bactéria láctica selecionada
previamente (UFC/g) foram determinados no
conteúdo luminal do intestino delgado, ceco e
cólon (as fezes também foram analisadas), de
camundongos gnotobióticos após 10 dias de
monoassociação. Durante o tratamento com
as bactérias lácticas, foram realizadas
contagens, em dias pré-estabelecidos, dos
níveis populacionais nas fezes dos animais
para verificação da capacidade de
colonização e de sobrevivência das mesmas,
como descrito por Rodrigues et al. (1996).
Análises
Os conteúdos dos órgãos foram
recolhidos, individualmente, em tubos
esterilizados e pesados. Foram, então,
homogeneizados e submetidos a diluições
decimais em salina tamponada. Alíquotas de
0,1 mL das diluições foram incorporadas em
ágar MRS (Difco), para os GN, e incubadas a
37ºC por 48-72 horas em câmara de
anaerobiose para enumeração das bactérias
lácticas, conforme descrito por Rodrigues et
al. (1996).
As mesmas porções foram submetidas
a um exame anatomopatológico para avaliar a
presença das bactérias lácticas no epitélio do
trato digestivo utilizando a coloração de PAS
(ácido periódico de Schiff) e para a avaliação
da inocuidade das bactérias lácticas pela
coloração de HE (hematoxilina-eosina).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os níveis populacionais do
Lactobacillus reuteri (11 A) foram
determinados no conteúdo luminal dos
animais GN. Este experimento foi realizado
visando demonstrar a efetiva colonização do
trato gastrintestinal dos animais gnotobióticos,
pelo microrganismo selecionado dentre os
seis iniciais devido suas características
probióticas. Os animais gnotobióticos
receberam cultura do microrganismo
inoculado pela via oral-gástrica. Os níveis
populacionais de L. reuteri (UFC/g) foram
determinados no conteúdo luminal do
intestino delgado, ceco e cólon (as fezes
também foram analisadas), de camundongos
gnotobióticos após 10 dias de
monoassociação. A Figura 1 apresenta os
níveis populacionais da bactéria no conteúdo
luminal dos órgãos de camundongos
gnotobióticos citados anteriormente.
Figura 1. Níveis populacionais de um Lactobacillus
reuteri (11 A), isolado de suíno adulto nas diversas
porções do trato gastrointestinal de camundongos
gnotobióticos (GN).
Os resultados mostram que a bactéria
é capaz de colonizar todas as porções do trato
digestivo dos animais gnotobióticos. Esses
níveis populacionais não variaram ao longo
dos dias, apresentando uma colonização
estável até o final do experimento (dados não
mostrados). Os níveis populacionais foram
bastante homogêneos, porém com leve
crescimento à medida que se aproximava das
porções mais inferiores do trato intestinal dos
animais. A variação foi bem menor, ou quase
ausente, no ceco e no cólon, onde, também,
os níveis populacionais foram maiores.
CONCLUSÃO
Conclui-se, até este momento, que este
microrganismo possui capacidade de
colonização do trato gastrointestinal de
camundongos gnotobióticos e que alcança

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níveis adequados à proteção nas diversas
porções estudadas. Espera-se, que L. reuteri
11 A, possa ser utilizado para a elaboração de
probiótico para suínos, visando substituir,
mesmo que parcialmente, os promotores de
crescimento antimicrobianos, atualmente
empregados nesta atividade produtiva.
Porém, para que tal probiótico possa vir a ser
aprovado, são necessários ensaios
demonstrando seus efeitos in vivo, além de
uma avaliação de seu impacto no crescimento
e ganho de peso dos suínos.
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profiling. Appl. and Environ. Microbiol., v. 56,
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____________________________________
1 - Graduação em Ciências Biológicas.
Professor Adjunto do Departamento de
Morfologia (DMO – CCBS) da Universidade
Federal de Sergipe - UFS, Brasil.
E-mail: flaviobarbosaufs@gmail.com
2 - Graduação em Fisioterapia. Mestrado em
Microbiogia. Departamento de Microbiologia
(ICB) da Universidade Federal de Minas
Gerais - UFMG, Brasil.
3 - Graduação em Medicina Veterinária.
Departamento de Microbiologia (ICB) da
Universidade Federal de Minas Gerais -
UFMG, Brasil.
4 - Graduação em Enfermagem. Professor
Adjunto do Curso de Enfermagem da
Universidade Federal do Amapá (UNIFAP),
Brasil.