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ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019
1
DETERMINAÇÃO DO EFEITO DE UM Lactobacillus reuteri COM POTENCIAL PARA
USO PROBIÓTICO ISOLADO DE SUÍNO ADULTO E CULTIVADO EM VINHOTO NA
MORTALIDADE POR Salmonella enterica serovar Typhimurium EM
CAMUNDONGOS GNOTOBIÓTICOS (GN)
DETERMINATION OF THE EFFECT OF A Lactobacillus reuteri WITH POTENTIAL FOR PROBIOTIC
USE ISOLATED FROM ADULT PIG AND CULTIVATED IN VINASSE IN THE MORTALITY OF Salmonella
enterica serovar Typhimurium IN GNOTOBIOTIC (GN) MICE
FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA1; FELIPE HENRIQUE SILVA BAMBIRRA2; LEANDRO
HENRIQUE SILVA BAMBIRRA3; RUBENS ALEX DE OLIVEIRA MENEZES4
RESUMO
A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado um desafio para todos
os profissionais que trabalham com toda a cadeia produtiva alimentícia. A produção mundial de suínos
cresceu e o Brasil teve um aumento significativo nas exportações de carne suína. Para que a atividade de
criação de suínos se mantenha produtiva, com a geração de lucros, promotores de crescimento têm sido
incorporados às rações, com objetivo de melhorar o processo digestivo e o desempenho zootécnico dos
animais, resultando em maior ganho de peso e redução do número de doenças. Entretanto, nos últimos anos
tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo destes produtos, bem como se tornado evidente os
possíveis transtornos à saúde destes animais e do homem, como consequências desta suplementação. As
alternativas disponíveis para substituição dos antimicrobianos na suinocultura incluem a utilização de
probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes fitoterápicos. Seguindo esta linha de raciocínio, este trabalho
se propôs a determinar o efeito de um Lactobacillus reuteri com potencial para uso probiótico isolado de suíno
adulto e cultivado em vinhoto na mortalidade por Salmonella enterica serovar Typhimurium em camundongos
gnotobióticos (GN). Os resultados não se mostraram significativos por meio da análise estatística, quando se
avaliou o evento morte. O tempo médio de vida para o grupo controle foi de 16 dias, o mesmo observado para
o grupo experimental.
PALAVRAS-CHAVE: Lactobacillus, suínos, probiótico, mortalidade.
ABSTRACT
The production of healthy and nutritious food in large quantities has become a challenge for all professionals
who work with the entire food production chain. World swine production grew and Brazil saw a significant
increase in exports. In order for the pig breeding activity to remain productive, with the generation of profits,
growth promoters have been incorporated into the rations, with the objective of improving the digestive process
and the zootechnical performance of the animals, resulting in greater weight gain and reduced number of
diseases. However, in recent years there has been an increase in awareness about the excessive use of these
products, as well as the possible health disorders of these animals and man, as consequences of this
supplementation, have become evident. The alternatives available to replace antimicrobials in pig farming
include the use of probiotics, prebiotics, symbiotics and herbal agents. Following this line of reasoning, this
work aimed to determine the effect of a Lactobacillus reuteri with potential for probiotic use isolated from adult
swine and cultivated in vinasse on mortality by Salmonella enterica serovar Typhimurium in gnotobiotic (GN)
mice. The results were not shown to be significant through statistical analysis, when the death event was
evaluated. The average life span for the control group was 16 days, the same observed for the experimental
group.
KEYWORDS: Lactobacillus, swine, probiotic, mortality.
ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019
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INTRODUÇÃO
A produção de alimentos saudáveis e
nutritivos em grande quantidade tem se
tornado um desafio para todos os profissionais
que trabalham com toda a cadeia produtiva
alimentícia. Estimativas indicam que o
suprimento de alimentos necessários para
atender aos requerimentos nutricionais da
população humana durante os próximos
quarenta anos equivale à quantidade
previamente produzida ao longo de toda a
história. Para atender a esta grande demanda
de alimentos de origem animal, os
pesquisadores têm se esforçado na busca de
novas tecnologias a fim de aumentar a
eficiência e a produtividade dos animais de
criação.
A suinocultura é um dos setores
agropecuários que mais tem crescido nas
últimas décadas. Segundo dados da
EMBRAPA, a produção de carne suína no
Brasil vem crescendo mais 5% ao ano desde
o ano de 2006. A produção mundial de suínos
cresceu sistematicamente nos últimos 30
anos e o Brasil teve um aumento significativo
nas exportações de carne suína, chegando à
quarta colocação mundial e, atualmente, esse
produto pode ser encontrado até na Rússia. A
este fato, associa-se um marcante aumento
no comércio e consumo de carne de suínos
em todo o mundo, sendo que sua produção
está rapidamente se expandindo em muitos
países em desenvolvimento, como o Brasil, o
que faz aumentar o rigor no manejo dos
animais e na produção da carne.
Para que a atividade de criação de
suínos se mantenha produtiva, com a geração
de lucros, muitos aditivos (incluindo
promotores de crescimento, como drogas
antimicrobianas) têm sido incorporados às
rações, com objetivo de melhorar o processo
digestivo e o desempenho zootécnico dos
animais, resultando em maior ganho de peso
e redução do número de doenças. Entretanto,
nos últimos anos tem aumentado a
conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os
possíveis transtornos à saúde destes animais
e do homem, como consequências desta
suplementação (FULLER, 1989, 1992;
FULLER & COLE, 1988; SALMINEN, 1998;
TANNOCK, 1986, 1990, 1995 e 2003).
Os antimicrobianos promotores de
crescimento podem alterar a microbiota do
trato digestivo e deprimir os mecanismos de
defesa dos animais, além de deixar resíduos
indesejáveis à saúde do homem na carne.
Além disso, a presença de concentrações
baixas de antimicrobianos pode ser
responsável pelo aumento dos fenômenos de
resistência bacteriana aos mesmos.
Recentemente, novos microrganismos
resistentes a uma ou várias drogas
antimicrobianas têm surgido e sido motivo de
preocupação para a saúde pública mundial.
Estes microrganismos modificados podem se
difundir pelo meio ambiente e estarem
presentes na carne dos animais.
Por causa destas evidências, a
ausência de microrganismos potencialmente
patogênicos e a ausência de resíduos de
produtos químicos têm se tornado os
principais indicadores de qualidade da carne
de suínos, bem como de outros alimentos.
Assim, a suinocultura brasileira precisará se
adaptar às futuras normas de comércio
internacional, pois alguns países
importadores, principalmente da União
Europeia, não mais aceitarão adquirir carne
de suínos oriunda de produtores que utilizam
antimicrobianos para aumentar os índices de
produtividade de seus plantéis (FULLER,
1989, 1992; FULLER & COLE, 1988;
SALMINEN, 1998; TANNOCK, 1986, 1990,
1995 e 2003).
Assim, tem gerado a necessidade de se
buscar alternativas que possam promover os
mesmos efeitos de produtividade
relacionados ao uso dos aditivos alimentares,
porém, sem causar as mesmas
consequências indesejáveis destes. Além
disto, ainda existem prejuízos relacionados ao
impacto econômico da retirada destas drogas
antimicrobianas da alimentação de suínos.
Isto representa aumento nos custos de
produção, sendo, principalmente, causados
por aumento no consumo de ração e no
período de ocupação dos galpões, menos
ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019
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ciclos produtivos por ano, além de mais gastos
com a mão-de-obra.
As alternativas disponíveis para
substituição dos antimicrobianos na
suinocultura incluem a utilização de
probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes
fitoterápicos. Dentre estas, a utilização dos
microrganismos probióticos constitui uma
perspectiva extremamente interessante, pois
as próprias bactérias benéficas da microbiota
intestinal dos animais poderiam ser
empregadas em substituição aos
antimicrobianos. Nestes casos, estes
microrganismos poderiam favorecer o
equilíbrio do ecossistema gastrintestinal, o
que seria refletido em melhoria da saúde e
boa produtividade. Trabalhos científicos têm
sido conduzidos tentando avaliar a eficiência
da utilização dos probióticos, em substituição
aos produtos químicos, para modular a saúde
de suínos comerciais e proporcionar um
ganho de peso adequado. Bactérias do
gênero Lactobacillus são os principais
microrganismos desejáveis encontrados em
grandes quantidades por todo o trato
gastrintestinal (TGI) de suínos, mostrando ser
fortes candidatas como probióticos para estes
animais (FULLER, 1989, 1992; FULLER &
COLE, 1988; SALMINEN, 1998; TANNOCK,
1986, 1990, 1995 e 2003).
Quanto aos Sistemas Agroindustriais
(SAG) existentes no Brasil, sabe-se que o
sucroalcooleiro se destaca pela importância
social, econômica e política. A crise do
Proálcool, após a década de 1990, foi
acompanhada por período de sensível
redução dos preços do açúcar no mercado
externo. Esse fato, associado à estagnação
no crescimento da demanda interna e no
aumento da produtividade agrícola e
industrial, desencadeou uma nova crise de
superprodução, existente até há pouco tempo.
Nessa nova configuração, a análise da
competitividade e de potencialidades para
novos empreendimentos com uso de
derivados da cana-de-açúcar aparece em
destaque. A cadeia produtiva da cana-de-
açúcar como fornecedora de produtos para o
mercado industrial e para exportação faz com
que as usinas intensifiquem seus esforços por
melhoria da produtividade, sendo que a
exigência dos clientes industriais as leva à
diferenciação de produtos com maior valor
agregado.
Dessa forma, uma diferente iniciativa
que o SAG Canavieiro poderia empreender
para reforçar sua competitividade nesta nova
configuração seria o aproveitamento das
oportunidades de diversificação na direção de
novos produtos oriundos da cana-de-açúcar e
seus derivados. Os empreendimentos para
diversificação das empresas mais bem
posicionadas do SAG estão sendo para
diferenciar suas commodities, açúcar e álcool,
em atividades complementares, tais como as
iniciativas para produção de produtos
resultantes de transformação de derivados da
cana-de-açúcar.
A reestruturação do SAG, na direção de
consolidar seu posicionamento nos mercados
interno e externo, apresenta grande impacto
na produção canavieira. Esse impacto é mais
forte principalmente em regiões do país onde
há predomínio da atividade canavieira.
Anuncia-se para essas regiões o aumento na
produção do álcool, dada sua
sobrevalorização em decorrência do
crescimento da demanda, devido às
exportações e do aumento dos preços do
petróleo e, ainda, do crescimento do mercado
interno, com os novos carros bicombustíveis e
a perspectiva de outros países adotarem
combustíveis menos poluidores.
De outro lado, o aumento da produção
de álcool acarretará um problema ao meio
ambiente, devido à maior quantidade de
vinhoto, resíduo produzido em grande volume,
qual seja na proporção de um litro de álcool
para 12 litros de vinhoto. O vinhoto distribuído
no solo, por meio de fertiirrigação dos talhões
de cana, apresenta já, nesse momento, várias
objeções de caráter ambiental: a primeira é
que a quantidade de vinhaça necessária para
a fertiirrigação da cana é inferior à quantidade
despejada, o que provoca comprometimento
dos lençóis freáticos e, no limite, até dos
lençóis mais profundos de água, como os
aquíferos. A segunda objeção é que as usinas
não possuem capacidade logística de
distribuição do vinhoto sobre toda a área
colhida de cana. Essa distribuição, em geral,
concentra-se nas áreas circunvizinhas às
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usinas, o que vem comprometendo a própria
produtividade da cana próxima. Isso reforça a
necessidade de pensar em soluções, ou que
reduzam o grau de concentração da vinhaça a
ser distribuída no solo, ou que seja expandida
a área de fertiirrigação ou ainda, que se
descubram novas aplicações tecnológicas
(VIAN, 2003; MOREIRA et al., 2002;
ASSUMPÇÃO, 2004).
Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs a determinar o efeito de um
Lactobacillus reuteri com potencial para uso
probiótico isolado de suíno adulto e cultivado
em vinhoto na mortalidade por Salmonella
enterica serovar Typhimurium em
camundongos gnotobióticos (GN).
MATERIAL E MÉTODOS
1. O Vinhoto
Foram utilizadas amostras de vinhoto
(produto resultante do destilado da cana-de-
açúcar) produzidas por “Vale Verde
Alambique e Parque Ecológico”, alambique de
cachaça localizado na rodovia MG 50, Km 39
– Bairro Vianópolis, município de Betim – MG.
As amostras foram acondicionadas e
transportadas em vasilhame de polietileno
tereftalato (PET) selados para evitar trocas
gasosas prevenindo a oxidação. Foram
realizadas análises físico-químicas e
estabilidade microbiológica durante o período
de estocagem.
2. Microrganismos
Características Morfo-tintoriais,
Bioquímicas e Fisiológicas dos
Microrganismos Isolados
Numa placa contendo em torno de 100
unidades formadoras de colônia (UFC), as
colônias morfologicamente diferentes e mais
significativas do ponto de vista populacional
foram repicadas, a partir do ágar MRS (Difco),
no mesmo meio. A partir de colônias, de cada
amostra, que apresentaram aspectos
morfológicos distintos foram feitos esfregaços
em lâminas para coloração pelo método de
Gram. Além disto, a partir dessas mesmas
colônias foram feitos testes de catalase em
lâmina, utilizando-se H2O2 (30%). Aqueles
que se apresentaram como Gram-positivo e
catalase negativa, sugestivos de pertencerem
ao gênero Lactobacillus, foram submetidos à
identificação, utilizando técnicas de biologia
molecular (PCR-ARDRA).
Purificação e Manutenção dos
Microrganismos Isolados
Os microrganismos isolados e
avaliados pelas características morfo-
tintoriais, bioquímicas e fisiológicas e pelo
teste respiratório foram inoculados em 5 mL
de caldo MRS (Difco), sendo em seguida
incubados em anaerobiose, à 37ºC durante 48
horas. Após o crescimento, uma alíquota de
500 µL de cada tubo foi transferida para tubo
eppendorf e adicionada de glicerol esterilizado
(50 µL), sendo, em seguida, congelados a -
18ºC e -86ºC, para posterior utilização,
quando necessário. O restante dos cultivos foi
destinado às análises baseadas em técnicas
de biologia molecular, com a finalidade de
identificação das espécies isoladas.
Ativação das culturas
Amostras de Lactobacillus spp.
isoladas a partir do TGI dos suínos (Sus scrofa
domesticus), oriundos de criação intensiva, e
pré-identificadas pelo perfil de fermentação de
carboidratos (kit API 50 CHL, BioMérieux,
Marcy l’Etoile, France), foram descongeladas
e inoculadas (200 µL) em caldo MRS (Difco).
O meio foi incubado, sob condições de
anaerobiose, a 37ºC, durante 48 horas. Após
cinco passagens em caldo, 50 µL de cada
amostra foram repicados em ágar MRS
(Difco), por três métodos diferentes: pour-
plate, espalhamento com auxílio da alça de
Drigalski e estria. Então, as placas foram
incubadas em anaerobiose, sendo mantidas a
37ºC, durante 48 horas.
Para a realização do teste a seguir, foi
escolhido o microrganismo entre o grupo de
doze os quais apresentaram crescimento
satisfatório em aerobiose dos trinta e um
isolados e identificados como Lactobacillus,
ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019
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sendo três originados de animais recém-
desmamados (21 dias) e três originados de
animais jovens/terminados (140 dias). Sendo
assim, a amostra L. reuteri - 11 A, foi a
escolhida para a realização dos testes in vivo,
tanto em camundongos por apresentar as
seguintes características relacionadas nos
itens abaixo:
- Apresentar menor sensibilidade ao
cultivo em vinhoto, conseguindo manter-se
viável e em concentrações mais elevadas por
maior tempo.
- Quando foi verificado o seu
crescimento, este microrganismo se
apresentou com boa capacidade de
multiplicação no vinhoto, destacando a
necessidade do incremento de nutrientes para
potencializar este resultado.
- Nas avaliações de adesão da
superfície celular o microrganismo
demonstrou possuir maiores probabilidades
de se fixar ao epitélio intestinal e maior
resistência à acidez.
- Em relação ao antagonismo in vitro, o
mesmo demonstrou-se eficaz contra os
microrganismos reveladores, tanto patógenos
como contra espécie relacionada
(Lactobacillus acidophilus), sugerindo a
produção de substâncias antagonista além do
antagonismo proveniente da produção de
ácidos.
- Mostrou-se bom colonizador do TGI
de camundongos, sendo que a colonização se
manteve estável por todo o período analisado.
- Não altera a estrutura histológica dos
órgãos analisados em camundongos, com os
mesmos se apresentando com aspectos
normais e se mostrando mais efetivo em
melhorar a lesão das vísceras (baço e fígado)
e de porções do trato digestivo (cólon, ceco e
íleo) induzida pela infecção.
Conclui-se, até este momento, que este
microrganismo poderia ser utilizado para a
elaboração de probiótico para suínos, visando
substituir, mesmo que parcialmente, os
promotores de crescimento antimicrobianos,
atualmente empregados nesta atividade
produtiva. Porém, para que tal probiótico
possa vir a ser aprovado, são necessários
ensaios demonstrando seus efeitos in vivo,
além de uma avaliação de seu impacto no
crescimento e ganho de peso dos suínos.
3. Animais
Animais Isentos de Germes (IG)
Foram usados camundongos isentos
de germes (NIH) de 21 dias de idade, de
ambos os sexos, derivados de um núcleo de
reprodução de camundongos provenientes da
Taconic Farms (Germantown, USA),
propagados no biotério de Gnotobiologia do
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG,
mantidos em isoladores flexíveis do tipo
Trexler (Standard Safety Equipment
Company, McHenry, USA) e manuseados de
acordo com técnicas já estabelecidas
(PLEASANTS, 1974) e adaptadas às nossas
condições (SILVA, 1986). Para os
experimentos, os animais foram mantidos em
microisoladores (UNO Roestvaststaal BV,
Zevenaar, Netherland) e receberam “ad
libitum”, ração “Nuvilab” comercializada pela
Nuvital (Curitiba, PR) e água esterilizados por
calor úmido.
Manejo dos Animais
A manutenção, e o manejo dos animais
nos experimentos foram conduzidos
respeitando-se o “Guide for the care and use
of laboratory animals” – National Research
Concil, Institute of Laboratory Animal
Resources, Washington, D.C., National
Academy Press, 1996.
4. Determinação do efeito de um
Lactobacillus reuteri com potencial para
uso probiótico isolado de suíno adulto e
cultivado em vinhoto na mortalidade por
Salmonella enterica serovar Typhimurium
em camundongos gnotobióticos (GN)
Desenho Experimental
Dois grupos de camundongos GN,
sendo um grupo controle, um grupo
experimental (previamente monoassociados
por dez dias com as bactérias lácticas
cultivadas em vinhoto), com vinte animais em
ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019
6
cada grupo, foram inoculados
intragastricamente com 0,1 mL de uma
suspensão contendo 102 células viáveis de S.
Typhimurium. No final de 28 dias de
experimento, os animais que não
apresentaram morte pela infecção foram
sacrificados por deslocamento cervical para
exames anatomopatológicos, conforme
descrito por RODRIGUES et al. (1996).
Análises
Durante o desafio com a S.
Typhimurium, a mortalidade acumulada foi
anotada e, ao final de 28 dias, os animais que
não apresentaram morte pela infecção foram
sacrificados por deslocamento cervical.
Durante todo o experimento foram realizadas
contagens das bactérias lácticas nos animais
experimentais.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Quando tratados com a bactéria láctica
L. reuteri - 11 A, os camundongos dos grupos
IG receberam um inóculo único de 107 células
(0,1 mL de uma cultura contendo 108
UFC/mL), por inoculação intra-gástrica, dez
dias antes do desafio com a bactéria
patogênica. A linhagem de Salmonella
enterica sorov. Typhimurium, utilizada como
desafio para os camundongos GN (controle e
experimental) foi fornecida em inóculos de 0,1
mL, contendo 102 UFC, por via oral através de
uma agulha de inoculação intra-gástrica no
décimo primeiro dia.
Neste experimento, os significados
estatísticos dos resultados obtidos foram
avaliados com a utilização do teste “Mann-
Whitney LogRank” do programa SIGMASTAT
(Jandel Scientific Software, versão 1.0, San
Rafael, USA), utilizando 0,05 como limiares de
confiança.
Mesmo tendo sido observado a morte
de todos os animais (10 no total) do grupo
controle aos 18 dias de experimento e a
sobrevivência de animais do grupo
experimental (dois sobreviventes contra
nenhum do grupo controle) até o décimo nono
dia de experimento (os animais morreram
antes de alcançar 28 dias, prazo final do
experimento), os resultados não se mostraram
significativos por meio da análise estatística
conforme resultado abaixo, quando se avaliou
o evento morte:
“The log rank statistic for the survival curves is
not great enough to exclude the possibility that
the difference is due to random sampling
variability; there is not a statistically significant
difference (P = 0,577)”.
O tempo médio de vida para o grupo controle
foi de 16 dias, o mesmo observado para o
grupo experimental. Segue abaixo a Figura 1,
o qual demonstra o resultado alcançado neste
experimento.
Figura 1. Determinação do efeito das bactérias lácticas
cultivadas em vinhoto na mortalidade por S.
Typhimurium em camundongos gnotobióticos (GN)
após a monoassociação com o L. reuteri (11 A).
CONCLUSÃO
Os resultados não se mostraram
significativos por meio da análise estatística,
quando se avaliou o evento morte. O tempo
médio de vida para o grupo controle foi de 16
ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019
7
dias, o mesmo observado para o grupo
experimental.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ASSUMPÇÃO, M.R.P. A competitividade do
sistema agroindustrial da cana-de-açúcar e
novos empreendimentos viáveis baseados na
utilização de matérias primas originadas da
cana-de-açúcar e seus derivados. 978 p.
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pelo IEL/CNI, realizado pelo Grupo de
Pesquisa DIVERICANA, UFSCAR. São
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FULLER, R. Probiotics. The scientific basis,
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MOREIRA, I.; MARCIS Jr., M.; FURNLAN,
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119-174, 1974.
RODRIGUES, A.C.; NARDI, R.M.;
BAMBIRRA, E.A.; VIEIRA, E.C.; NICOLI, J.R.
Effect of Saccharomyces boulardii against
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SILVA, M.E. Modelos experimentais para o
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VIAN, C.E. de F. Agroindústria canavieira –
estratégias competitivas e modernização.
Campinas: Editora Átomo, 216 p., 2003.
____________________________________
1 - Graduação em Ciências Biológicas. Professor
Adjunto do Departamento de Morfologia (DMO –
CCBS) da Universidade Federal de Sergipe - UFS,
Brasil.
E-mail: flaviobarbosaufs@gmail.com
2 - Graduação em Fisioterapia. Mestrado em
Microbiogia. Departamento de Microbiologia (ICB) da
Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG, Brasil.
3 - Graduação em Medicina Veterinária. Departamento
de Microbiologia (ICB) da Universidade Federal de
Minas Gerais - UFMG, Brasil.
4 - Graduação em Enfermagem. Professor Adjunto do
Curso de Enfermagem da Universidade Federal do
Amapá (UNIFAP), Brasil.

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  • 1. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019 1 DETERMINAÇÃO DO EFEITO DE UM Lactobacillus reuteri COM POTENCIAL PARA USO PROBIÓTICO ISOLADO DE SUÍNO ADULTO E CULTIVADO EM VINHOTO NA MORTALIDADE POR Salmonella enterica serovar Typhimurium EM CAMUNDONGOS GNOTOBIÓTICOS (GN) DETERMINATION OF THE EFFECT OF A Lactobacillus reuteri WITH POTENTIAL FOR PROBIOTIC USE ISOLATED FROM ADULT PIG AND CULTIVATED IN VINASSE IN THE MORTALITY OF Salmonella enterica serovar Typhimurium IN GNOTOBIOTIC (GN) MICE FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA1; FELIPE HENRIQUE SILVA BAMBIRRA2; LEANDRO HENRIQUE SILVA BAMBIRRA3; RUBENS ALEX DE OLIVEIRA MENEZES4 RESUMO A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado um desafio para todos os profissionais que trabalham com toda a cadeia produtiva alimentícia. A produção mundial de suínos cresceu e o Brasil teve um aumento significativo nas exportações de carne suína. Para que a atividade de criação de suínos se mantenha produtiva, com a geração de lucros, promotores de crescimento têm sido incorporados às rações, com objetivo de melhorar o processo digestivo e o desempenho zootécnico dos animais, resultando em maior ganho de peso e redução do número de doenças. Entretanto, nos últimos anos tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo destes produtos, bem como se tornado evidente os possíveis transtornos à saúde destes animais e do homem, como consequências desta suplementação. As alternativas disponíveis para substituição dos antimicrobianos na suinocultura incluem a utilização de probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes fitoterápicos. Seguindo esta linha de raciocínio, este trabalho se propôs a determinar o efeito de um Lactobacillus reuteri com potencial para uso probiótico isolado de suíno adulto e cultivado em vinhoto na mortalidade por Salmonella enterica serovar Typhimurium em camundongos gnotobióticos (GN). Os resultados não se mostraram significativos por meio da análise estatística, quando se avaliou o evento morte. O tempo médio de vida para o grupo controle foi de 16 dias, o mesmo observado para o grupo experimental. PALAVRAS-CHAVE: Lactobacillus, suínos, probiótico, mortalidade. ABSTRACT The production of healthy and nutritious food in large quantities has become a challenge for all professionals who work with the entire food production chain. World swine production grew and Brazil saw a significant increase in exports. In order for the pig breeding activity to remain productive, with the generation of profits, growth promoters have been incorporated into the rations, with the objective of improving the digestive process and the zootechnical performance of the animals, resulting in greater weight gain and reduced number of diseases. However, in recent years there has been an increase in awareness about the excessive use of these products, as well as the possible health disorders of these animals and man, as consequences of this supplementation, have become evident. The alternatives available to replace antimicrobials in pig farming include the use of probiotics, prebiotics, symbiotics and herbal agents. Following this line of reasoning, this work aimed to determine the effect of a Lactobacillus reuteri with potential for probiotic use isolated from adult swine and cultivated in vinasse on mortality by Salmonella enterica serovar Typhimurium in gnotobiotic (GN) mice. The results were not shown to be significant through statistical analysis, when the death event was evaluated. The average life span for the control group was 16 days, the same observed for the experimental group. KEYWORDS: Lactobacillus, swine, probiotic, mortality.
  • 2. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019 2 INTRODUÇÃO A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado um desafio para todos os profissionais que trabalham com toda a cadeia produtiva alimentícia. Estimativas indicam que o suprimento de alimentos necessários para atender aos requerimentos nutricionais da população humana durante os próximos quarenta anos equivale à quantidade previamente produzida ao longo de toda a história. Para atender a esta grande demanda de alimentos de origem animal, os pesquisadores têm se esforçado na busca de novas tecnologias a fim de aumentar a eficiência e a produtividade dos animais de criação. A suinocultura é um dos setores agropecuários que mais tem crescido nas últimas décadas. Segundo dados da EMBRAPA, a produção de carne suína no Brasil vem crescendo mais 5% ao ano desde o ano de 2006. A produção mundial de suínos cresceu sistematicamente nos últimos 30 anos e o Brasil teve um aumento significativo nas exportações de carne suína, chegando à quarta colocação mundial e, atualmente, esse produto pode ser encontrado até na Rússia. A este fato, associa-se um marcante aumento no comércio e consumo de carne de suínos em todo o mundo, sendo que sua produção está rapidamente se expandindo em muitos países em desenvolvimento, como o Brasil, o que faz aumentar o rigor no manejo dos animais e na produção da carne. Para que a atividade de criação de suínos se mantenha produtiva, com a geração de lucros, muitos aditivos (incluindo promotores de crescimento, como drogas antimicrobianas) têm sido incorporados às rações, com objetivo de melhorar o processo digestivo e o desempenho zootécnico dos animais, resultando em maior ganho de peso e redução do número de doenças. Entretanto, nos últimos anos tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo destes produtos, bem como se tornado evidente os possíveis transtornos à saúde destes animais e do homem, como consequências desta suplementação (FULLER, 1989, 1992; FULLER & COLE, 1988; SALMINEN, 1998; TANNOCK, 1986, 1990, 1995 e 2003). Os antimicrobianos promotores de crescimento podem alterar a microbiota do trato digestivo e deprimir os mecanismos de defesa dos animais, além de deixar resíduos indesejáveis à saúde do homem na carne. Além disso, a presença de concentrações baixas de antimicrobianos pode ser responsável pelo aumento dos fenômenos de resistência bacteriana aos mesmos. Recentemente, novos microrganismos resistentes a uma ou várias drogas antimicrobianas têm surgido e sido motivo de preocupação para a saúde pública mundial. Estes microrganismos modificados podem se difundir pelo meio ambiente e estarem presentes na carne dos animais. Por causa destas evidências, a ausência de microrganismos potencialmente patogênicos e a ausência de resíduos de produtos químicos têm se tornado os principais indicadores de qualidade da carne de suínos, bem como de outros alimentos. Assim, a suinocultura brasileira precisará se adaptar às futuras normas de comércio internacional, pois alguns países importadores, principalmente da União Europeia, não mais aceitarão adquirir carne de suínos oriunda de produtores que utilizam antimicrobianos para aumentar os índices de produtividade de seus plantéis (FULLER, 1989, 1992; FULLER & COLE, 1988; SALMINEN, 1998; TANNOCK, 1986, 1990, 1995 e 2003). Assim, tem gerado a necessidade de se buscar alternativas que possam promover os mesmos efeitos de produtividade relacionados ao uso dos aditivos alimentares, porém, sem causar as mesmas consequências indesejáveis destes. Além disto, ainda existem prejuízos relacionados ao impacto econômico da retirada destas drogas antimicrobianas da alimentação de suínos. Isto representa aumento nos custos de produção, sendo, principalmente, causados por aumento no consumo de ração e no período de ocupação dos galpões, menos
  • 3. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019 3 ciclos produtivos por ano, além de mais gastos com a mão-de-obra. As alternativas disponíveis para substituição dos antimicrobianos na suinocultura incluem a utilização de probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes fitoterápicos. Dentre estas, a utilização dos microrganismos probióticos constitui uma perspectiva extremamente interessante, pois as próprias bactérias benéficas da microbiota intestinal dos animais poderiam ser empregadas em substituição aos antimicrobianos. Nestes casos, estes microrganismos poderiam favorecer o equilíbrio do ecossistema gastrintestinal, o que seria refletido em melhoria da saúde e boa produtividade. Trabalhos científicos têm sido conduzidos tentando avaliar a eficiência da utilização dos probióticos, em substituição aos produtos químicos, para modular a saúde de suínos comerciais e proporcionar um ganho de peso adequado. Bactérias do gênero Lactobacillus são os principais microrganismos desejáveis encontrados em grandes quantidades por todo o trato gastrintestinal (TGI) de suínos, mostrando ser fortes candidatas como probióticos para estes animais (FULLER, 1989, 1992; FULLER & COLE, 1988; SALMINEN, 1998; TANNOCK, 1986, 1990, 1995 e 2003). Quanto aos Sistemas Agroindustriais (SAG) existentes no Brasil, sabe-se que o sucroalcooleiro se destaca pela importância social, econômica e política. A crise do Proálcool, após a década de 1990, foi acompanhada por período de sensível redução dos preços do açúcar no mercado externo. Esse fato, associado à estagnação no crescimento da demanda interna e no aumento da produtividade agrícola e industrial, desencadeou uma nova crise de superprodução, existente até há pouco tempo. Nessa nova configuração, a análise da competitividade e de potencialidades para novos empreendimentos com uso de derivados da cana-de-açúcar aparece em destaque. A cadeia produtiva da cana-de- açúcar como fornecedora de produtos para o mercado industrial e para exportação faz com que as usinas intensifiquem seus esforços por melhoria da produtividade, sendo que a exigência dos clientes industriais as leva à diferenciação de produtos com maior valor agregado. Dessa forma, uma diferente iniciativa que o SAG Canavieiro poderia empreender para reforçar sua competitividade nesta nova configuração seria o aproveitamento das oportunidades de diversificação na direção de novos produtos oriundos da cana-de-açúcar e seus derivados. Os empreendimentos para diversificação das empresas mais bem posicionadas do SAG estão sendo para diferenciar suas commodities, açúcar e álcool, em atividades complementares, tais como as iniciativas para produção de produtos resultantes de transformação de derivados da cana-de-açúcar. A reestruturação do SAG, na direção de consolidar seu posicionamento nos mercados interno e externo, apresenta grande impacto na produção canavieira. Esse impacto é mais forte principalmente em regiões do país onde há predomínio da atividade canavieira. Anuncia-se para essas regiões o aumento na produção do álcool, dada sua sobrevalorização em decorrência do crescimento da demanda, devido às exportações e do aumento dos preços do petróleo e, ainda, do crescimento do mercado interno, com os novos carros bicombustíveis e a perspectiva de outros países adotarem combustíveis menos poluidores. De outro lado, o aumento da produção de álcool acarretará um problema ao meio ambiente, devido à maior quantidade de vinhoto, resíduo produzido em grande volume, qual seja na proporção de um litro de álcool para 12 litros de vinhoto. O vinhoto distribuído no solo, por meio de fertiirrigação dos talhões de cana, apresenta já, nesse momento, várias objeções de caráter ambiental: a primeira é que a quantidade de vinhaça necessária para a fertiirrigação da cana é inferior à quantidade despejada, o que provoca comprometimento dos lençóis freáticos e, no limite, até dos lençóis mais profundos de água, como os aquíferos. A segunda objeção é que as usinas não possuem capacidade logística de distribuição do vinhoto sobre toda a área colhida de cana. Essa distribuição, em geral, concentra-se nas áreas circunvizinhas às
  • 4. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019 4 usinas, o que vem comprometendo a própria produtividade da cana próxima. Isso reforça a necessidade de pensar em soluções, ou que reduzam o grau de concentração da vinhaça a ser distribuída no solo, ou que seja expandida a área de fertiirrigação ou ainda, que se descubram novas aplicações tecnológicas (VIAN, 2003; MOREIRA et al., 2002; ASSUMPÇÃO, 2004). Seguindo esta linha de raciocínio, este trabalho se propôs a determinar o efeito de um Lactobacillus reuteri com potencial para uso probiótico isolado de suíno adulto e cultivado em vinhoto na mortalidade por Salmonella enterica serovar Typhimurium em camundongos gnotobióticos (GN). MATERIAL E MÉTODOS 1. O Vinhoto Foram utilizadas amostras de vinhoto (produto resultante do destilado da cana-de- açúcar) produzidas por “Vale Verde Alambique e Parque Ecológico”, alambique de cachaça localizado na rodovia MG 50, Km 39 – Bairro Vianópolis, município de Betim – MG. As amostras foram acondicionadas e transportadas em vasilhame de polietileno tereftalato (PET) selados para evitar trocas gasosas prevenindo a oxidação. Foram realizadas análises físico-químicas e estabilidade microbiológica durante o período de estocagem. 2. Microrganismos Características Morfo-tintoriais, Bioquímicas e Fisiológicas dos Microrganismos Isolados Numa placa contendo em torno de 100 unidades formadoras de colônia (UFC), as colônias morfologicamente diferentes e mais significativas do ponto de vista populacional foram repicadas, a partir do ágar MRS (Difco), no mesmo meio. A partir de colônias, de cada amostra, que apresentaram aspectos morfológicos distintos foram feitos esfregaços em lâminas para coloração pelo método de Gram. Além disto, a partir dessas mesmas colônias foram feitos testes de catalase em lâmina, utilizando-se H2O2 (30%). Aqueles que se apresentaram como Gram-positivo e catalase negativa, sugestivos de pertencerem ao gênero Lactobacillus, foram submetidos à identificação, utilizando técnicas de biologia molecular (PCR-ARDRA). Purificação e Manutenção dos Microrganismos Isolados Os microrganismos isolados e avaliados pelas características morfo- tintoriais, bioquímicas e fisiológicas e pelo teste respiratório foram inoculados em 5 mL de caldo MRS (Difco), sendo em seguida incubados em anaerobiose, à 37ºC durante 48 horas. Após o crescimento, uma alíquota de 500 µL de cada tubo foi transferida para tubo eppendorf e adicionada de glicerol esterilizado (50 µL), sendo, em seguida, congelados a - 18ºC e -86ºC, para posterior utilização, quando necessário. O restante dos cultivos foi destinado às análises baseadas em técnicas de biologia molecular, com a finalidade de identificação das espécies isoladas. Ativação das culturas Amostras de Lactobacillus spp. isoladas a partir do TGI dos suínos (Sus scrofa domesticus), oriundos de criação intensiva, e pré-identificadas pelo perfil de fermentação de carboidratos (kit API 50 CHL, BioMérieux, Marcy l’Etoile, France), foram descongeladas e inoculadas (200 µL) em caldo MRS (Difco). O meio foi incubado, sob condições de anaerobiose, a 37ºC, durante 48 horas. Após cinco passagens em caldo, 50 µL de cada amostra foram repicados em ágar MRS (Difco), por três métodos diferentes: pour- plate, espalhamento com auxílio da alça de Drigalski e estria. Então, as placas foram incubadas em anaerobiose, sendo mantidas a 37ºC, durante 48 horas. Para a realização do teste a seguir, foi escolhido o microrganismo entre o grupo de doze os quais apresentaram crescimento satisfatório em aerobiose dos trinta e um isolados e identificados como Lactobacillus,
  • 5. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019 5 sendo três originados de animais recém- desmamados (21 dias) e três originados de animais jovens/terminados (140 dias). Sendo assim, a amostra L. reuteri - 11 A, foi a escolhida para a realização dos testes in vivo, tanto em camundongos por apresentar as seguintes características relacionadas nos itens abaixo: - Apresentar menor sensibilidade ao cultivo em vinhoto, conseguindo manter-se viável e em concentrações mais elevadas por maior tempo. - Quando foi verificado o seu crescimento, este microrganismo se apresentou com boa capacidade de multiplicação no vinhoto, destacando a necessidade do incremento de nutrientes para potencializar este resultado. - Nas avaliações de adesão da superfície celular o microrganismo demonstrou possuir maiores probabilidades de se fixar ao epitélio intestinal e maior resistência à acidez. - Em relação ao antagonismo in vitro, o mesmo demonstrou-se eficaz contra os microrganismos reveladores, tanto patógenos como contra espécie relacionada (Lactobacillus acidophilus), sugerindo a produção de substâncias antagonista além do antagonismo proveniente da produção de ácidos. - Mostrou-se bom colonizador do TGI de camundongos, sendo que a colonização se manteve estável por todo o período analisado. - Não altera a estrutura histológica dos órgãos analisados em camundongos, com os mesmos se apresentando com aspectos normais e se mostrando mais efetivo em melhorar a lesão das vísceras (baço e fígado) e de porções do trato digestivo (cólon, ceco e íleo) induzida pela infecção. Conclui-se, até este momento, que este microrganismo poderia ser utilizado para a elaboração de probiótico para suínos, visando substituir, mesmo que parcialmente, os promotores de crescimento antimicrobianos, atualmente empregados nesta atividade produtiva. Porém, para que tal probiótico possa vir a ser aprovado, são necessários ensaios demonstrando seus efeitos in vivo, além de uma avaliação de seu impacto no crescimento e ganho de peso dos suínos. 3. Animais Animais Isentos de Germes (IG) Foram usados camundongos isentos de germes (NIH) de 21 dias de idade, de ambos os sexos, derivados de um núcleo de reprodução de camundongos provenientes da Taconic Farms (Germantown, USA), propagados no biotério de Gnotobiologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG, mantidos em isoladores flexíveis do tipo Trexler (Standard Safety Equipment Company, McHenry, USA) e manuseados de acordo com técnicas já estabelecidas (PLEASANTS, 1974) e adaptadas às nossas condições (SILVA, 1986). Para os experimentos, os animais foram mantidos em microisoladores (UNO Roestvaststaal BV, Zevenaar, Netherland) e receberam “ad libitum”, ração “Nuvilab” comercializada pela Nuvital (Curitiba, PR) e água esterilizados por calor úmido. Manejo dos Animais A manutenção, e o manejo dos animais nos experimentos foram conduzidos respeitando-se o “Guide for the care and use of laboratory animals” – National Research Concil, Institute of Laboratory Animal Resources, Washington, D.C., National Academy Press, 1996. 4. Determinação do efeito de um Lactobacillus reuteri com potencial para uso probiótico isolado de suíno adulto e cultivado em vinhoto na mortalidade por Salmonella enterica serovar Typhimurium em camundongos gnotobióticos (GN) Desenho Experimental Dois grupos de camundongos GN, sendo um grupo controle, um grupo experimental (previamente monoassociados por dez dias com as bactérias lácticas cultivadas em vinhoto), com vinte animais em
  • 6. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019 6 cada grupo, foram inoculados intragastricamente com 0,1 mL de uma suspensão contendo 102 células viáveis de S. Typhimurium. No final de 28 dias de experimento, os animais que não apresentaram morte pela infecção foram sacrificados por deslocamento cervical para exames anatomopatológicos, conforme descrito por RODRIGUES et al. (1996). Análises Durante o desafio com a S. Typhimurium, a mortalidade acumulada foi anotada e, ao final de 28 dias, os animais que não apresentaram morte pela infecção foram sacrificados por deslocamento cervical. Durante todo o experimento foram realizadas contagens das bactérias lácticas nos animais experimentais. RESULTADOS E DISCUSSÃO Quando tratados com a bactéria láctica L. reuteri - 11 A, os camundongos dos grupos IG receberam um inóculo único de 107 células (0,1 mL de uma cultura contendo 108 UFC/mL), por inoculação intra-gástrica, dez dias antes do desafio com a bactéria patogênica. A linhagem de Salmonella enterica sorov. Typhimurium, utilizada como desafio para os camundongos GN (controle e experimental) foi fornecida em inóculos de 0,1 mL, contendo 102 UFC, por via oral através de uma agulha de inoculação intra-gástrica no décimo primeiro dia. Neste experimento, os significados estatísticos dos resultados obtidos foram avaliados com a utilização do teste “Mann- Whitney LogRank” do programa SIGMASTAT (Jandel Scientific Software, versão 1.0, San Rafael, USA), utilizando 0,05 como limiares de confiança. Mesmo tendo sido observado a morte de todos os animais (10 no total) do grupo controle aos 18 dias de experimento e a sobrevivência de animais do grupo experimental (dois sobreviventes contra nenhum do grupo controle) até o décimo nono dia de experimento (os animais morreram antes de alcançar 28 dias, prazo final do experimento), os resultados não se mostraram significativos por meio da análise estatística conforme resultado abaixo, quando se avaliou o evento morte: “The log rank statistic for the survival curves is not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0,577)”. O tempo médio de vida para o grupo controle foi de 16 dias, o mesmo observado para o grupo experimental. Segue abaixo a Figura 1, o qual demonstra o resultado alcançado neste experimento. Figura 1. Determinação do efeito das bactérias lácticas cultivadas em vinhoto na mortalidade por S. Typhimurium em camundongos gnotobióticos (GN) após a monoassociação com o L. reuteri (11 A). CONCLUSÃO Os resultados não se mostraram significativos por meio da análise estatística, quando se avaliou o evento morte. O tempo médio de vida para o grupo controle foi de 16
  • 7. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N2, 2019 7 dias, o mesmo observado para o grupo experimental. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ASSUMPÇÃO, M.R.P. A competitividade do sistema agroindustrial da cana-de-açúcar e novos empreendimentos viáveis baseados na utilização de matérias primas originadas da cana-de-açúcar e seus derivados. 978 p. Relatório Final. UFSCar, Estudo contrato 165 pelo IEL/CNI, realizado pelo Grupo de Pesquisa DIVERICANA, UFSCAR. São Carlos, 2004. FULLER, R. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol., v. 66, p. 365-378, 1989. FULLER, R. Probiotics. The scientific basis, London: Chapman & Hall, 328 p., 1992. FULLER, R.; COLE, C.B. The Scientific Basic of the Probiotic Concept. In: Probiotic: Theory and Applications. Marlows: Chalcombe Publications, p. 1-14, 1988. MOREIRA, I.; MARCIS Jr., M.; FURNLAN, A.C.; PATRICIO, V.M.I.; OLIVEIRA, G.C. Uso da levedura seca por “spray-dry” como fonte de proteína para suínos em crescimento e terminação. Rev Bras Zootec, v. 31, p. 962- 969, 2002. PLEASANTS, J.R. Gnotobiotics. In: Melby Jr., E.C., Altmann, N.H. Handbook of Laboratory Animal Science, Cleveland: CRC Press, p. 119-174, 1974. RODRIGUES, A.C.; NARDI, R.M.; BAMBIRRA, E.A.; VIEIRA, E.C.; NICOLI, J.R. Effect of Saccharomyces boulardii against experimental oral infection with Salmonella typhimurium and Shigella flexneri in conventional and gnotobiotic mice. J. Appl. Bacteriol., v. 81, p. 251-256, 1996. SALMINEN, S. Clinical applications of probiotic bacteria. Int. Dairy J., v. 8, p. 563- 572, 1998. SILVA, M.E. Modelos experimentais para o estudo de doença de Chagas, camundongos e ratos isentos de germes e convencionais, Belo Horizonte: Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas, 1986, Dissertação (Mestrado). TANNOCK, G.W. Microbial interactions and influences in gastrointestinal tract. Lactobacilli and the gastrointestinal tract. Proc. IV ISME, p. 526-532, 1986. TANNOCK, G. W. More than a smell: the complexity of the normal microflora. In: TANNOCK, G. W. (Ed.). Normal Microflora. An Introduction to Microbes Inhabiting the Human Body. New Zealand: Chapman & Hall., p. 1- 36, 1995. TANNOCK, G.W. Probiotics and prebiotics: where we are going? Wymondham: Caister Academic Press. 54 p., 2003. TANNOCK, G.W.; FULLER, R.; PEDERSEN, K. Lactobacillus succession in the piglet digestive tract demonstrated by plasma profiling. Appl. and Environ. Microbiol., v. 56, p. 1310-1316, 1990. VIAN, C.E. de F. Agroindústria canavieira – estratégias competitivas e modernização. Campinas: Editora Átomo, 216 p., 2003. ____________________________________ 1 - Graduação em Ciências Biológicas. Professor Adjunto do Departamento de Morfologia (DMO – CCBS) da Universidade Federal de Sergipe - UFS, Brasil. E-mail: flaviobarbosaufs@gmail.com 2 - Graduação em Fisioterapia. Mestrado em Microbiogia. Departamento de Microbiologia (ICB) da Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG, Brasil. 3 - Graduação em Medicina Veterinária. Departamento de Microbiologia (ICB) da Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG, Brasil. 4 - Graduação em Enfermagem. Professor Adjunto do Curso de Enfermagem da Universidade Federal do Amapá (UNIFAP), Brasil.