Este documento descreve um estudo que caracterizou a superfície celular de bactérias do gênero Lactobacillus isoladas de fezes de suínos através de testes de adesão a solventes. Os resultados indicaram que a amostra L. reuteri - 11 A apresentou maior probabilidade de adesão às células epiteliais intestinais e resistência à acidez, características importantes para um potencial probiótico.

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CARACTERIZAÇÃO DA SUPERFÍCIE CELULAR POR MEIO DO TESTE DE ADESÃO
A SOLVENTES DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE ÁCIDO LÁCTICO
(Lactobacillus spp.) COM POTENCIAL PROBIÓTICO ISOLADOS DAS FEZES DE
SUÍNOS (Sus scrofa domesticus)
CHARACTERIZATION OF THE CELLULAR SURFACE THROUGH THE LACTIC ACID PRODUCING
MICRO-ORGANISM SOLVENT TEST (Lactobacillus spp.) WITH PROBIOTIC POTENTIAL ISOLATED
FROM SWINE FEES (Sus scrofa domesticus)
FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA1; FELIPE HENRIQUE SILVA BAMBIRRA2; LEANDRO
HENRIQUE SILVA BAMBIRRA3; RUBENS ALEX DE OLIVEIRA MENEZES4
RESUMO
A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado um desafio para todos os
profissionais que trabalham com toda a cadeia produtiva alimentícia. A produção mundial de suínos cresceu e o Brasil
teve um aumento significativo nas exportações de carne suína. Para que a atividade de criação de suínos se mantenha
produtiva, com a geração de lucros, promotores de crescimento têm sido incorporados às rações, com objetivo de
melhorar o processo digestivo e o desempenho zootécnico dos animais, resultando em maior ganho de peso e redução
do número de doenças. Entretanto, nos últimos anos tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os possíveis transtornos à saúde destes animais e do homem, como
consequências desta suplementação. As alternativas disponíveis para substituição dos antimicrobianos na suinocultura
incluem a utilização de probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes fitoterápicos. Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs a caracterizar a superfície celular por meio do teste de adesão a solventes de microrganismos
produtores de ácido láctico (Lactobacillus spp.) com potencial probiótico isolados das fezes de suínos (Sus scrofa
domesticus). De acordo com a característica probiótica estudada (perfil de adesão), algumas amostras de microrganismos
isolados do conteúdo fecal de suínos se destacam quando o objetivo almejado é a utilização para a elaboração de
produtos probióticos que poderão ser administrados via oral para os animais, logo após o nascimento, durante o desmame
(creche) e em outras fases da cadeia produtiva. Em relação aos resultados das avaliações de adesão in vitro da superfície
celular das amostras de bactérias isoladas, o microrganismo L. reuteri - 11 A demonstrou possuir maiores probabilidades
de adesão de suas células ao epitélio intestinal (alto valor para a substância hidrofóbica - xilol) e de resistir à acidez (alto
valor para o solvente ácido - clorofórmio).
PALAVRAS-CHAVE: Lactobacillus, bactérias lácticas, suínos, probiótico.
ABSTRACT
The production of healthy and nutritious food in large quantities has become a challenge for all professionals who work
with the entire food production chain. World swine production grew and Brazil saw a significant increase in exports. In
order for the pig breeding activity to remain productive, with the generation of profits, growth promoters have been
incorporated into the rations, with the objective of improving the digestive process and the zootechnical performance of
the animals, resulting in greater weight gain and reduced number of diseases. However, in recent years there has been
an increase in awareness about the excessive use of these products, as well as the possible health disorders of these
animals and man, as consequences of this supplementation, have become evident. The alternatives available to replace
antimicrobials in pig farming include the use of probiotics, prebiotics, symbiotics and herbal agents. Following this line of
reasoning, this work aimed to characterize the cell surface through the test of adhesion to solvents of microorganisms
producing lactic acid (Lactobacillus spp.) with probiotic potential isolated from swine feces (Sus scrofa domesticus).
According to the probiotic characteristic studied (adhesion profile), some samples of microorganisms isolated from the
fecal content of pigs stand out when the aim is to use probiotic products that can be administered orally to the animals,
right after birth, during weaning (day care) and at other stages of the production chain. In relation to the results of in vitro
adherence assessments of the cell surface of samples of isolated bacteria, the microorganism L. reuteri - 11 A has shown
greater probability of adherence of its cells to the intestinal epithelium (high value for the hydrophobic substance - xylol)
and to resist acidity (high value for acidic solvent - chloroform).
KEYWORDS: Lactobacillus, lactic bacteria, swine, probiotic.

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INTRODUÇÃO
A produção de alimentos saudáveis e
nutritivos em grande quantidade tem se
tornado um desafio para todos os profissionais
que trabalham com toda a cadeia produtiva
alimentícia. Estimativas indicam que o
suprimento de alimentos necessários para
atender aos requerimentos nutricionais da
população humana durante os próximos
quarenta anos equivale à quantidade
previamente produzida ao longo de toda a
história. Para atender a esta grande demanda
de alimentos de origem animal, os
pesquisadores têm se esforçado na busca de
novas tecnologias a fim de aumentar a
eficiência e a produtividade dos animais de
criação.
A suinocultura é um dos setores
agropecuários que mais tem crescido nas
últimas décadas. Segundo dados da
EMBRAPA, a produção de carne suína no
Brasil vem crescendo mais 5% ao ano desde
o ano de 2006. A produção mundial de suínos
cresceu sistematicamente nos últimos 30
anos e o Brasil teve um aumento significativo
nas exportações de carne suína, chegando à
quarta colocação mundial e, atualmente, esse
produto pode ser encontrado até na Rússia. A
este fato, associa-se um marcante aumento
no comércio e consumo de carne de suínos
em todo o mundo, sendo que sua produção
está rapidamente se expandindo em muitos
países em desenvolvimento, como o Brasil, o
que faz aumentar o rigor no manejo dos
animais e na produção da carne.
Para que a atividade de criação de
suínos se mantenha produtiva, com a geração
de lucros, muitos aditivos (incluindo
promotores de crescimento, como drogas
antimicrobianas) têm sido incorporados às
rações, com objetivo de melhorar o processo
digestivo e o desempenho zootécnico dos
animais, resultando em maior ganho de peso
e redução do número de doenças. Entretanto,
nos últimos anos tem aumentado a
conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os
possíveis transtornos à saúde destes animais
e do homem, como consequências desta
suplementação.
Os antimicrobianos promotores de
crescimento podem alterar a microbiota do
trato digestivo e deprimir os mecanismos de
defesa dos animais, além de deixar resíduos
indesejáveis à saúde do homem na carne.
Além disso, a presença de concentrações
baixas de antimicrobianos pode ser
responsável pelo aumento dos fenômenos de
resistência bacteriana aos mesmos.
Recentemente, novos microrganismos
resistentes a uma ou várias drogas
antimicrobianas têm surgido e sido motivo de
preocupação para a saúde pública mundial.
Estes microrganismos modificados podem se
difundir pelo meio ambiente e estarem
presentes na carne dos animais.
Por causa destas evidências, a
ausência de microrganismos potencialmente
patogênicos e a ausência de resíduos de
produtos químicos têm se tornado os
principais indicadores de qualidade da carne
de suínos, bem como de outros alimentos.
Assim, a suinocultura brasileira precisará se
adaptar às futuras normas de comércio
internacional, pois alguns países
importadores, principalmente da União
Europeia, não mais aceitarão adquirir carne
de suínos oriunda de produtores que utilizam
antimicrobianos para aumentar os índices de
produtividade de seus plantéis.
Assim, tem gerado a necessidade de se
buscar alternativas que possam promover os
mesmos efeitos de produtividade
relacionados ao uso dos aditivos alimentares,
porém, sem causar as mesmas
consequências indesejáveis destes. Além
disto, ainda existem prejuízos relacionados ao
impacto econômico da retirada destas drogas
antimicrobianas da alimentação de suínos.
Isto representa aumento nos custos de
produção, sendo, principalmente, causados
por aumento no consumo de ração e no
período de ocupação dos galpões, menos
ciclos produtivos por ano, além de mais gastos
com a mão-de-obra.
As alternativas disponíveis para
substituição dos antimicrobianos na
suinocultura incluem a utilização de

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probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes
fitoterápicos. Dentre estas, a utilização dos
microrganismos probióticos constitui uma
perspectiva extremamente interessante, pois
as próprias bactérias benéficas da microbiota
intestinal dos animais poderiam ser
empregadas em substituição aos
antimicrobianos. Nestes casos, estes
microrganismos poderiam favorecer o
equilíbrio do ecossistema gastrintestinal, o
que seria refletido em melhoria da saúde e
boa produtividade. Trabalhos científicos têm
sido conduzidos tentando avaliar a eficiência
da utilização dos probióticos, em substituição
aos produtos químicos, para modular a saúde
de suínos comerciais e proporcionar um
ganho de peso adequado. Bactérias do
gênero Lactobacillus são os principais
microrganismos desejáveis encontrados em
grandes quantidades por todo o trato
gastrintestinal (TGI) de suínos, mostrando ser
fortes candidatas como probióticos para estes
animais.
Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs a caracterizar a superfície
celular por meio do teste de adesão a
solventes de microrganismos produtores de
ácido láctico (Lactobacillus spp.) com
potencial probiótico isolados das fezes de
suínos (Sus scrofa domesticus).
MATERIAL E MÉTODOS
1. Microrganismos
Características Morfo-tintoriais,
Bioquímicas e Fisiológicas dos
Microrganismos Isolados
Numa placa contendo em torno de 100
unidades formadoras de colônia (UFC), as
colônias morfologicamente diferentes e mais
significativas do ponto de vista populacional
foram repicadas, a partir do ágar MRS (Difco),
no mesmo meio. A partir de colônias, de cada
amostra, que apresentaram aspectos
morfológicos distintos foram feitos esfregaços
em lâminas para coloração pelo método de
Gram. Além disto, a partir dessas mesmas
colônias foram feitos testes de catalase em
lâmina, utilizando-se H2O2 (30%). Aqueles
que se apresentaram como Gram-positivo e
catalase negativa, sugestivos de pertencerem
ao gênero Lactobacillus, foram submetidos à
identificação, utilizando técnicas de biologia
molecular (PCR-ARDRA).
Purificação e Manutenção dos
Microrganismos Isolados
Os microrganismos isolados e
avaliados pelas características morfo-
tintoriais, bioquímicas e fisiológicas e pelo
teste respiratório foram inoculados em 5 mL
de caldo MRS (Difco), sendo em seguida
incubados em anaerobiose, à 37ºC durante 48
horas. Após o crescimento, uma alíquota de
500 µL de cada tubo foi transferida para tubo
eppendorf e adicionada de glicerol esterilizado
(50 µL), sendo, em seguida, congelados a -
18ºC e -86ºC, para posterior utilização,
quando necessário. O restante dos cultivos foi
destinado às análises baseadas em técnicas
de biologia molecular, com a finalidade de
identificação das espécies isoladas.
Ativação das culturas
Amostras de Lactobacillus spp.
isoladas a partir do TGI dos suínos (Sus scrofa
domesticus), oriundos de criação intensiva, e
pré-identificadas pelo perfil de fermentação de
carboidratos (kit API 50 CHL, BioMérieux,
Marcy l’Etoile, France), foram descongeladas
e inoculadas (200 µL) em caldo MRS (Difco).
O meio foi incubado, sob condições de
anaerobiose, a 37ºC, durante 48 horas. Após
cinco passagens em caldo, 50 µL de cada
amostra foram repicados em ágar MRS
(Difco), por três métodos diferentes: pour-
plate, espalhamento com auxílio da alça de
Drigalski e estria. Então, as placas foram
incubadas em anaerobiose, sendo mantidas a
37ºC, durante 48 horas.
Para a realização do teste a seguir,
foram escolhidos seis microrganismos entre o
grupo de doze os quais apresentaram
crescimento satisfatório em aerobiose dos
trinta e um isolados e identificados como
Lactobacillus, sendo três originados de
animais recém-desmamados (21 dias) e três

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originados de animais jovens/terminados (140
dias). Estas linhagens alcançaram melhores
resultados nos testes anteriores de
crescimento, viabilidade e manutenção
(estocagem) em função da atmosfera e do
meio de cultura a partir de vinhoto de cana-de-
açúcar suplementado com diferentes fontes
de carbono e nitrogênio. Dessa forma, os
microrganismos de interesse probiótico
escolhidos para os demais testes foram:
 06 J - Lactobacillus mucosae
 14 J - Lactobacillus ruminis
 18 J - Lactobacillus johnsonii
 08 A - Lactobacillus salivarius
 11 A - Lactobacillus reuteri
 13 A - Lactobacillus acidophilus
2. Teste de Adesão a Solventes da
Superfície Celular dos Microrganismos
Produtores de Ácido Láctico Isolados das
Fezes de Suínos (Sus scrofa domesticus)
O método foi realizado em duplicata
para cada amostra analisada, de acordo com
as técnicas descritas por ROSENBERG et al.
(1983), PELLETIER et al. (1997) e PÉREZ et
al. (1998), com modificações. Os
microrganismos isolados foram ativados em
caldo MRS (Difco), incubado sob
anaerobiose, a 37 ºC, durante 24 horas. Após
três ativações, os cultivos foram centrifugados
a 1.100-1.500 g, por 15 minutos. Em seguida,
as células foram lavadas duas vezes com
solução tampão KH2PO4-Na2HPO4 (50 mM,
pH 7,0) e, posteriormente, as mesmas foram
suspensas em solução de KNO3 (0,1 M, pH
6,2). Em tubos de vidro, 4 mL de cada
suspensão bacteriana obtida foram
adicionados de 1 mL dos seguintes solventes:
xilol (solvente apolar), clorofórmio (solvente
ácido) e acetato de etila (solvente básico).
Após repouso por 5 minutos, as fases foram
misturadas por agitação em vórtex por 2
minutos. Então, os tubos foram mantidos em
repouso por 30-60 minutos,
aproximadamente, para que as fases se
separassem completamente. Após esse
período, foi feita a leitura de absorbância da
fase aquosa a 600 nanômetros em
espectrofotômetro.
Branco = 5 mL de solução de KNO3
DOA  Amostra = 5 mL de solução de KNO3 + Células
DOB  Amostra = 4 mL de suspensão celular em
solução de KNO3 + 1 mL dos solventes em cada tubo
A porcentagem de adesão bacteriana
ao solvente foi obtida de acordo com a
seguinte fórmula:
% adesão = (DOA – DOB) x 100
DOA
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A aderência das bactérias à mucosa
intestinal, sejam patogênicas ou não, envolve
a participação de adesinas bacterianas, da
composição da parede celular e de receptores
da mucosa intestinal. A interação entre esses
elementos promove a fixação da bactéria à
mucosa (aderência) o que impede sua
eliminação pelo peristaltismo intestinal e pelas
correntes de fluidos que tendem levá-las para
o exterior do organismo. A capacidade de
aderir às células derivadas da mucosa
intestinal ou à própria mucosa, já foi
demonstrada, para a maioria das cepas de
Lactobacillus e Bifidobacterium utilizadas
como probióticos (TRABULSI & SAMPAIO,
2000).
A adesão bacteriana depende em parte
de interações reversíveis ou irreversíveis. O
estágio inicial e reversível é mediado por um
complexo de interações físico-químicas,
incluindo hidrofobicidade e cargas, que não
são consideradas específicas, mas,
propriedades importantes (PELLETIER,
1997). A propriedade de exclusão ou redução
da aderência de enteropatógenos já foi
demonstrada para vários probióticos,
provavelmente sendo consequência do
bloqueio de receptores que seriam utilizados
pelos mesmos. A importância dessa
propriedade é óbvia, pois ela contribui para o
efeito protetor dos probióticos contra
infecções intestinais (WALKER, 1998).

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Em relação à persistência e
multiplicação, são propriedades importantes,
porque sem elas não poderia ocorrer a
implantação do probiótico, essencial para que
a microbiota seja modificada em sua
composição ou atividade. Para que haja
multiplicação do probiótico, ele deve competir
com a microbiota presente, pelos nutrientes
necessários e encontrar as condições
favoráveis de atmosfera e pH. Vários estudos
experimentais têm demonstrado a
sobrevivência dos probióticos nos intestinos
do homem e de animais de laboratório. A
produção de ácidos, principalmente ácido
láctico, torna o ambiente intestinal bastante
desfavorável à proliferação de
microrganismos patógenos ou putrefativos. A
acidez do conteúdo intestinal parece ser
também importante para favorecer o
peristaltismo intestinal, combatendo assim a
constipação ou prisão de ventre (TANNOCK,
2003).
Ao se verificar os resultados dos testes
de adesão da superfície celular dos
microrganismos isolados do conteúdo fecal de
suínos (ver Figura 1), pode-se perceber que
os valores individuais mais altos de
porcentagem de adesão, em quatro
microrganismos dos seis analisados, foram
obtidos com o solvente ácido clorofórmio,
Portanto, baseando-se nas características de
superfície externa da maioria dos
microrganismos estudados, as suas
capacidades de adesão a estruturas
presentes no meio exterior seriam favorecidas
por interações em pH ácido.
Figura 1. Perfil de hidrofobicidade dos Lactobacillus
isolados do conteúdo fecal de suínos recém-
desmamados e terminados, cultivados em MRS.
Os microrganismos produtores de
ácido láctico que apresentaram maiores
valores de porcentagem de adesão in vitro,
sem se levar em consideração a natureza do
solvente, foram: 11 A - Lactobacillus reuteri,
18 J - Lactobacillus johnsonii, 06 J -
Lactobacillus mucosae, 14 J - Lactobacillus
ruminis, 08 A - Lactobacillus salivarius, 13 A-
Lactobacillus acidophilus “like”.
Quando os resultados do teste de
adesão in vitro são avaliados em relação aos
solventes e os microrganismos utilizados nos
testes, diferenças estatísticas (p<0,05) não
puderam ser verificadas, como mostra o
resultado encontrado: p = 0,944.
A amostra de Lactobacillus reuteri (11
A) e Lactobacillus johnsonii (18 J), cultivadas
em caldo MRS, apresentaram os valores
numéricos de porcentagem de adesão mais
altos quando o solvente apolar xilol foi
utilizado. Como a adesão de bactérias à
mucosa do TGI é determinada por interações
hidrofóbicas (MACARI & FURLAM, 2005),
estas amostras de Lactobacillus podem ser
consideradas como prováveis candidatas
(mesmo que preliminarmente) para a
elaboração de probióticos suínos. Esta seria
uma característica importante para a seleção
de um microrganismo na composição de um
probiótico. Este fato foi demonstrado por
Guillot (2001), quando uma amostra probiótica
de Enterococcus faecium foi capaz de
colonizar um intestino axênico e gnotoxênico
de ave após uma única administração.
Jin et al. (1998) encontraram altos
índices de adesão in vitro de células de
Lactobacillus acidophilus. Cravens et al.
(1998) demonstraram que as diferenças de
capacidade de adesão entre as bactérias
estão relacionadas com a presença de
elementos e substâncias no meio. O cálcio
pode favorecer esta interação, enquanto
agentes quelantes inibem a adesão de
Lactobacillus às células das mucosas. A
capacidade de adesão de células de
Lactobacillus acidophilus às mucosas do TGI
também pode ser determinada pela presença
de proteínas de superfície (KAHALA et al.,
1997). Neste trabalho, porém, não se
observou taxas de adesão mais altas no
microrganismo desta espécie (13 A). Este

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fato, que é determinado geneticamente,
poderia representar uma desvantagem
evolutiva para esta linhagem, favorecendo a
sua não-fixação ou seu estabelecimento em
determinado ecossistema.
A hidrofobicidade in vitro de células de
Lactobacillus spp. também foi estudada e
comprovada por Gusils et al. (1999), que
verificaram haver diferenças de valores de
adesão, de acordo com as espécies de
microrganismos. Os autores também
sugeriram esta propriedade como uma
característica favorável ao crescimento e
competição nos sitos do TGI.
Entretanto, existem questionamentos
sobre a importância da adesão às células do
TGI, uma vez que em situações normais,
praticamente todos os receptores estão
ocupados por microrganismos que já se
estabeleceram há mais tempo (TANNOCK,
2003). Neste caso, estes microrganismos que
não se aderem precisam se multiplicar
rapidamente para compensar a eliminação
causada pelo peristaltismo intestinal (MACARI
& FURLAM, 2005).
O conhecimento da fisiologia do
microrganismo a ser utilizado como probiótico
é essencial. A microbiota aderida ao epitélio
tem grande importância, pois confere
proteção física ao hospedeiro e possui efeito
de modulação imunológica. Microrganismos
com capacidade de adesão às vilosidades
intestinais são promissores como probióticos.
Microrganismos que permanecem livres no
lúmen podem ter a desvantagem de terem que
ser constantemente inoculados caso a
velocidade de trânsito intestinal seja superior
à velocidade de multiplicação do
microrganismo. Entretanto, estes últimos
podem apresentar outras características
probióticas que justificariam sua
administração constante.
Desta forma, talvez não fosse prudente
excluir uma amostra de microrganismo na
elaboração de um probiótico, baseando-se
apenas na sua potencial capacidade de
adesão. Se tal microrganismo possuir outras
propriedades probióticas, o mesmo pode ser
continuamente administrado para garantir
seus efeitos benéficos ao hospedeiro.
CONCLUSÃO
De acordo com a característica
probiótica estudada (perfil de adesão),
algumas amostras de microrganismos
isolados do conteúdo fecal de suínos se
destacam quando o objetivo almejado é a
utilização para a elaboração de produtos
probióticos que poderão ser administrados via
oral para os animais, logo após o nascimento,
durante o desmame (creche) e em outras
fases da cadeia produtiva.
Em relação aos resultados das
avaliações de adesão in vitro da superfície
celular das amostras de bactérias isoladas, o
microrganismo L. reuteri - 11 A demonstrou
possuir maiores probabilidades de adesão de
suas células ao epitélio intestinal (alto valor
para a substância hidrofóbica - xilol) e de
resistir à acidez (alto valor para o solvente
ácido - clorofórmio).
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________________________________________
1 - Graduação em Ciências Biológicas.
Professor Adjunto do Departamento de
Morfologia (DMO – CCBS) da Universidade
Federal de Sergipe - UFS, Brasil.
E-mail: flaviobarbosaufs@gmail.com
2 - Graduação em Fisioterapia. Mestrado em
Microbiogia. Departamento de Microbiologia
(ICB) da Universidade Federal de Minas
Gerais - UFMG, Brasil.
3 - Graduação em Medicina Veterinária.
Departamento de Microbiologia (ICB) da
Universidade Federal de Minas Gerais -
UFMG, Brasil.
4 - Graduação em Enfermagem. Professor
Adjunto do Curso de Enfermagem da
Universidade Federal do Amapá (UNIFAP),
Brasil.