Este documento descreve uma pesquisa sobre a produção de uma substância antagonista por uma linhagem de Ruminococcus gnavus isolada da microbiota intestinal humana. Experimentos moleculares comprovaram que a substância é uma bacteriocina chamada ruminococcina A, cujo gene não é plasmidial. Além disso, quando cultivado na presença de tripsina, R. gnavus produz um lantibiótico antibacteriano da classe IIA. Os resultados mostram que R. gnavus produz uma bacteriocina ativada por tripsina, uma enzima

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PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIA ANTAGONISTA POR UMA LINHAGEM DE
Ruminococcus gnavus DA MICROBIOTA FECAL DE SERES HUMANOS – UMA
ANÁLISE MOLECULAR
PRODUCTION OF ANTAGONIST SUBSTANCE BY A LINE OF Ruminococcus gnavus FROM THE
FECAL MICROBIOTA OF HUMAN BEINGS - A MOLECULAR ANALYSIS
FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA1; FELIPE HENRIQUE SILVA BAMBIRRA2; LEANDRO
HENRIQUE SILVA BAMBIRRA3; RUBENS ALEX DE OLIVEIRA MENEZES4
RESUMO
O termo microbiota indígena refere-se à população de microrganismos que habita as superfícies e mucosas
de pessoas sadias. Quando dominante essa microbiota desempenha funções importantes na manutenção da
saúde do hospedeiro, entre as quais a resistência à colonização (RC) por patógenos é uma das mais
importantes. A RC pode ser o resultado da competição por sítios de ligação ou por nutrientes e/ou da inibição
de patógenos pela produção de metabólicos tóxicos, substâncias antibióticas ou bacteriocinas. Este trabalho
teve como objetivo avaliar uma cultura de Ruminococcus gnavus quanto ao seu efeito antagonista resultante
da produção de substância difusível por meio de análises moleculares. A linhagem de R. gnavus foi isolada
da microbiota fecal dominante de um adulto sadio. Experimentos mediante a construção de primers
específicos tomando por base trabalhos com R. gnavus anteriormente publicados, comprovaram que a
substância produzida pelo microrganismo é uma bacteriocina já descrita e conhecida como ruminococcin A
(RumA), cujo gene não é plasmidial. Quando cultivado na presença de tripsina, R. gnavus pode produzir uma
substância anti-bacteriana pertencente à classe IIA dos lantibióticos. Concluindo, os resultados mostram que
o R. gnavus é capaz de produzir uma bacteriocina que é ativada na presença da tripsina, enzima produzida
pelo hospedeiro do microrganismo. Esses dados reforçam um raro caso descrito de “colaboração” entre uma
bactéria e o hospedeiro que a aloja para eliminar um alvo patogênico.
PALAVRAS-CHAVE: Ruminococcus gnavus, bacteriocina, antagonismo, microbiota.
ABSTRACT
The term indigenous microbiota refers to the population of microorganisms that inhabits the surfaces and
mucous membranes of healthy people. When dominant, this microbiota plays important roles in maintaining
the health of the host, among which resistance to colonization (CR) by pathogens is one of the most important.
CR can be the result of competition for binding sites or nutrients and / or the inhibition of pathogens by the
production of toxic metabolites, antibiotic substances or bacteriocins. This work aimed to evaluate a culture of
Ruminococcus gnavus for its antagonistic effect resulting from the production of diffusible substance through
molecular analyzes. The R. gnavus strain was isolated from the dominant fecal microbiota of a healthy adult.
Experiments through the construction of specific primers based on work with R. gnavus previously published,
proved that the substance produced by the microorganism is a bacteriocin already described and known as
ruminococcin A (RumA), whose gene is not plasmid. When grown in the presence of trypsin, R. gnavus can
produce an antibacterial substance belonging to the class IIA of lantibiotics. In conclusion, the results show
that R. gnavus is capable of producing a bacteriocin that is activated in the presence of trypsin, an enzyme
produced by the host of the microorganism. These data reinforce a rare case of "collaboration" between a
bacterium and the host that hosts it to eliminate a pathogenic target.
KEYWORDS: Ruminococcus gnavus, bacteriocin, antagonism, microbiota.

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INTRODUÇÃO
A formação da microbiota normal, com
a qual o homem convive por toda a vida, tem
início no momento do nascimento, pois, ao
passar pelo canal do parto, ele recebe os
primeiros componentes de sua microbiota. A
microbiota normal distribui-se pelas partes do
corpo que estão em contato com o meio
externo, isto é, pele e mucosas. Todavia, tanto
no que se refere à quantidade como à
qualidade, a microbiota não é uniforme. Na
verdade, cada uma das regiões habitadas
possui uma microbiota com características
próprias.
Com especial atenção à microbiota
intestinal, sabe-se, que o número de bactérias
neste sítio é dez vezes maior que o número de
células que formam os nossos órgãos e
tecidos, isto é, 1014 bactérias para 1013 células
humanas.
A microbiota intestinal desempenha
inúmeras funções, muitas das quais somente
agora começam a ser desvendadas. Por
muitos anos, vários pesquisadores
acreditavam que a microbiota intestinal não
tinha nenhuma importância para a saúde do
hospedeiro. Hoje, já se sabe que a microbiota
normal é um complexo e dinâmico
ecossistema que oferece várias funções de
interesse para o hospedeiro, incluindo
contribuição nutricional, imunomodulação e a
proteção ecológica contra microrganismos
patogênicos.
Esta microbiota associada tem uma
complexidade espacial e temporal que difere
por nicho ecológico, idade, localização
geográfica, estado de saúde, dieta e espécie
animal do hospedeiro. A relação entre a
composição da microbiota e as funções
resultantes é muito pouco conhecida, o que
dificulta entender como os fatores
perturbadores podem interferir sobre a
atuação da microbiota em relação à saúde do
hospedeiro.
A colonização do trato gastrointestinal
por cerca de 700-1000 espécies diferentes
torna difícil distinguir as contribuições
específicas por espécies individuais às
relações hospedeiro-microbiota e entre os
próprios microrganismos. A maioria das
espécies indígenas é anaeróbia estrita e é
difícil de cultivar, identificar e quantificar.
Dentre estas relações entre os
microrganismos que ocorrem no trato
gastrointestinal, destacamos neste trabalho,
aqueles os quais são produtores de
substâncias antagonistas, como as
bacteriocinas, sendo encontrados
naturalmente no trato intestinal do homem e
de animais fazendo parte da microbiota
dominantes em roedores, suínos e primatas
humanos e não-humanos. Devido ao fato da
microbiota intestinal constituir um
ecossistema altamente competitivo, a
produção de compostos antagonistas pelos
seus componentes representa uma vantagem
ecológica no controle dos níveis populacionais
de outras espécies patogênicas ou não.
Um Ruminococcus gnavus,
anteriormente identificado como
Peptostreptococcus sp., de origem intestinal
humano foi isolado e demonstrou produzir in
vivo e ex vivo substância antagonista contra
espécies não relacionadas, destacando-se a
inibição de Clostridium perfringens,
responsável por quadros de intoxicação.
As espécies do gênero Ruminococcus
são cocos Gram-positivo, anaeróbios, de
tamanho e forma variáveis, encontrados no
trato gastrointestinal e que fazem parte da
microbiota indígena do homem e de animais,
principalmente ruminantes. Possuem forma
esférica ou ovóide, com 0,5-1,2 μm de
diâmetro, são imóveis e não esporulam; têm
como temperatura ótima de crescimento
37°C. Apesar da maior complexidade da
classificação taxonômica da maioria das
bactérias nestes últimos anos, a dos cocos
anaeróbios foi simplificada.
Obtêm seus nutrientes quebrando a
celulose que vem através do sistema digestivo
do organismo do hospedeiro. Estes
organismos são também capazes de
fermentar a glicose e a xilose.
São encontrados vários estudos de
microrganismos do gênero Ruminococcus
como habitantes do rúmen do gado, dos
carneiros, e das cabras. São encontrados
também em cavalos, porcos e mamíferos

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selvagens. Estes organismos permitem que
seus hospedeiros digiram a celulose. Essas
habilidades com relação a degradação da
celulose são atualmente uma área de estudo
principal. Compreendendo como estes
organismos degradam a celulose, o setor
pecuarista pode fazer avanços na
produtividade animal. Além deste fato, este
conhecimento poderia gerar também um
impacto ambiental benéfico, já que alguns
grupos de pesquisadores trabalham visando
desenvolver melhores métodos de reciclagem
de materiais como papel e madeira
(MURDOCH, 1998; KRAUSE et al., 1998;
GOMEZ et al., 2002a; GOMEZ et al., 2002b;
MARCILLE et al., 2002; BEAUD et al., 2005).
Alguns microrganismos deste gênero
possuem a capacidade de produzir
substâncias antagonistas e bacteriocinas,
algumas inclusive já caracterizadas. Esta
produção já foi documentada extensivamente
nos últimos anos. Determinou-se uma
classificação específica não só ao gênero
Ruminococcus, mas também, a outros
microrganismos produtores de bacteriocina.
Embora as substâncias antagonistas,
principalmente as bacteriocinas, sejam
extensivamente pesquisadas, parece não
existir até o momento, uma elucidação
completa a respeito do tema. Além disso, a
produção dessas substâncias antagonistas é,
geralmente demonstrada e estudada in vitro,
ficando a dúvida da sua produção e papel in
vivo, sob condições das mais variadas
possíveis, no ecossistema digestivo.
Diante deste fato, em 1993, RAMARE
et al., demonstraram em testes de
antagonismo in vitro e in vivo, que um
Peptostreptococcus sp., não é capaz de inibir
o crescimento de C. perfringens, na ausência
da tripsina secretada pelo hospedeiro. Este
acontecimento serviu para chamar a atenção
para a pesquisa da produção de substância
antagonista sob diferentes aspectos e
condições. A caracterização da produção de
substância antagonista com a ajuda de
análises moleculares se faz necessária
visando credenciar tal microrganismo como
um probiótico para se poder pensar em utilizá-
la como método de eliminação de patógenos
e tratamento de infecções entéricas diversas.
Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs a avaliar uma linhagem de
Ruminococcus gnavus quanto às condições
de produção de substância antagonista por
métodos moleculares específicos,
caracterizando a substância inibitória
produzida pelo microrganismo.
MATERIAL E MÉTODOS
1. Bactéria Produtora de Substância
Antagonista
Para a realização do trabalho, foi
utilizada a linhagem bacteriana de
Ruminococcus gnavus, coco Gram-positivo,
anaeróbio estrito, sendo anteriormente
catalogada como Peptostreptococcus A2
(NICOLI & RAIBAUD, 1990). Esta linhagem foi
isolada de fezes de um ser humano adulto
saudável tendo sido, gentilmente, cedida pelo
professor Pierre Raibaud do Laboratoire
d´Ecologie Microbienne INRA, Jouy-n-Josas,
França.
2. Manutenção da Linhagem
Bacteriana
A linhagem bacteriana (Ruminococcus
gnavus foi conservada em 0,2 mL de glicerina,
esterilizada por calor seco, com 1 mL da
cultura de 24-48 horas a 37 oC crescidas em
caldo Brain Heart Infusion - BHI (DIFCO,
Detroit, USA), suplementado com 0,5% de
extrato de levedura, 0,1% de hemina e 0,1%
de menadiona – BHI-S (HOLDMAN et al.,
1977).
3. Técnicas de Biologia Molecular
3.1 Caracterização e Identificação
Molecular de Ruminococcus gnavus
O microrganismo isolado da microbiota
dominante fecal de um ser humano saudável,
sendo que este apresentou um potente efeito
antagonista contra C. Perfringens em modelo
gnotobiótico (NICOLI & RAIBAUD, 1990), foi
identificado fenotipicamente, por meio de
provas bioquímicas como Peptostreptococcus

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sp.. Esta bactéria foi submetida à análise da
sequência de rDNA 16S, e posteriormente
identificado como Ruminococcus gnavus.
Estas análises, citadas a seguir, com
exceção da “extração de DNA plasmidial”,
foram realizadas na Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA (Centro
Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo), em
Sete Lagoas, Minas Gerais. A extração de
DNA plasmidial foi realizada no Laboratório de
Genética de Protozoários Parasitos do
Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais.
3.2 Extração de DNA total
A extração do DNA total do
microrganismo foi realizada a partir do cultivo
recente em caldo BHI-S de uma colônia
isolada de um cultivo em agar BHI-S,
incubado sob anaerobiose, a 37 ºC, durante
24-48 horas, como descrito anteriormente.
3.3 Obtenção dos Protoplastos e Lise
das Células
O microrganismo a ser identificado, que
cresceu em caldo BHI-S (50 mL) foi
centrifugado a 1.500 g, durante 30 minutos, à
temperatura de 4ºC, para obtenção dos
pellets. Os sobrenadantes foram descartados.
Os pellets foram lavados com 10 mL de água
deionizada e centrifugados a 1.500 g, durante
10 minutos. Os pellets foram suspensos em
500 µL de tampão TNE (Tris 1,0 M, NaCl 3,0
M e EDTA 0,5 M). Logo após, passaram pelo
sonicador por 1 minuto para auxiliar no
processo de lise celular.
3.4 Extração do DNA
Em cada tubo, foram acrescentados
400 µL de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1)
e 100 µL de SDS 20%. Incubou as amostras à
temperatura ambiente, por meia hora, com a
finalidade de extrair proteínas associadas à
parede bacteriana. Em seguida, os tubos
foram centrifugados a 15.350 g, durante 2
minutos e recuperou-se a fase aquosa
superior. Esta fase foi transferida para outros
tubos e foi adicionado novamente 400 µL de
clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e agitou as
amostras em vortex por 30 segundos. Os
tubos foram centrifugados a 15.350 g, durante
2 minutos e mais uma vez recuperou-se a fase
aquosa superior. Transferidos mais uma vez,
adicionou-se então, 500 µL de
fenol/clorofórmio (1:1) e agitou as amostras
em vortex por 30 segundos. Mais uma vez, os
tubos foram centrifugados a 15.350 g, durante
2 minutos e recuperou-se a fase aquosa
superior. No próximo passo, foi adicionado
500 µL de clorofórmio e agitou as amostras
em vortex por 30 segundos. Os tubos foram
centrifugados a 15.350 g, durante 2 minutos e
pela quarta vez recuperou-se a fase aquosa
superior. Neste ponto, adicionou-se 2,5
volumes (1.250 µL) de etanol absoluto, e
procedeu mistura por inversão e logo após
armazenou-se as amostras à 20 °C por,
aproximadamente 2 horas. Em seguida a este
intervalo, centrifugou-se os tubos a 15.350 g,
durante 15 minutos a 4 °C e fez-se o descarte
do etanol. Os pellets foram lavados
rapidamente com etanol 70% e deixados em
repouso para a secagem completa. Por fim, os
pellets foram suspensos em 100 µL de água
deionizada autoclavada.
3.5 Quantificação do DNA
Com o objetivo de visualizar a
quantidade de DNA total extraído na etapa
anterior, as amostras de DNA extraído foram
submetidas à eletroforese em gel de agarose.
Cinco L de cada amostra de DNA total
extraído foram misturados com 5 L de
tampão TAE (adicionado de azul de
bromofenol). Em seguida, foi realizada a
eletroforese em gel de agarose (1%),
adicionado de 2 L de brometo de etídeo,
utilizando 80 Volts, durante 60 minutos.
Paralelamente, no mesmo gel, foi utilizado o
marcador de peso molecular de 1 Kb. Ao
término da corrida, os géis foram fotografados,
através de equipamento de
fotodocumentação, sob incidência de luz
ultravioleta.
3.6 Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR)

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Posteriormente, as amostras de DNA
total foram submetidas à reação de PCR,
visando amplificar a região intergênica
espaçadora entre a subunidade ribosomal
(16S), utilizando iniciadores universais que se
anelam nas regiões conservadas dos genes
16S rDNA. Esta região do DNA é bastante
variável entre as espécies de microrganismos,
porém, bastante conservada em
microrganismos da mesma espécie, sendo
então, utilizada em pesquisas de identificação
microbiana, ao nível molecular (BARRY et al.,
1991).
Em seguida, os tubos eppendorf,
contendo as amostras de DNA com os
reagentes, foram colocados dentro da
máquina termocicladora MJ Research
(Watertown, Massachussets, USA), sendo
utilizado o seguinte programa:
Posteriormente, 5 L de cada produto
de PCR foram misturados com 5 L do
tampão TAE com azul de bromofenol, e então,
submetidos à nova eletroforese em gel de
agarose (1,0 %), adicionado de 2 L de
brometo de etídeo, utilizando 80 Volts, durante
60 minutos. Ao final da corrida, os géis foram
fotografados, para visualização das regiões
amplificadas.
3.7 Purificação do DNA
Após a obtenção dos produtos de PCR,
os mesmos foram submetidos ao processo de
purificação utilizando-se o kit “GENECLEAN
II” (Qbiogene, Inc., Morgan Irvine, USA).
3.8 Sequenciamento rDNA de
Ruminococcus gnavus
Para identificação do microrganismo,
foi feito o sequenciamento de seu DNA
(TANNOCK et al., 1999). Esta análise foi
realizada no Laboratório de Bioquímica
Molecular da EMBRAPA – Centro Nacional de
Pesquisa de Milho e Sorgo, em Sete Lagoas,
Minas Gerais.
Para obtenção do DNA purificado, as
bandas amplificadas dos géis de agarose,
após a reação de PCR foram cortadas, e foi
utilizado um kit específico (GENECLEAN II). O
DNA purificado foi reamplificado para
realização da reação de seqüenciamento, em
um equipamento ABI 3100 - MegaBACETM
DNA Analysis Systems (Amersham
Biosciences, USA).
Após a reamplificação do DNA, foi
preparado um mix conforme quadro abaixo
(quantidade suficiente para uma reação):
Para o preparo das amostras de DNA
para o sequenciamento, foi distribuído 9 L do
mix para cada tubo. Adicionou-se 1 L de DNA
e o tubo colocado em uma máquina

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termocicladora MJ Research, sendo utilizado
o seguinte programa:
Duração 30 ciclos
96 °C 20 segundos
50 °C 10 segundos
60 °C 4 minutos
Logo após, procedeu-se o processo de
precipitação, adicionando 40 L de
isopropanol 75%. O material foi mantido a
temperatura ambiente por 15 minutos e
centrifugado passado este período, a 15.350
g, por 20 minutos a 20 °C. Fez-se o descarte
do sobrenadante e adicionou 100 µL de etanol
70% (Merck, Darmstadt, Alemanha).
Novamente, a amostra foi centrifugada, porém
por 10 minutos, a 15.350 g, a 20 °C. O
sobrenadante foi descartado e seco a
temperatura ambiente protegida da luz.
Depois da secagem, o material foi suspenso
em 10 µL de formamida Hi-Di. O DNA, pôde
ser então, desnaturado a 95 °C por 5 minutos
e resfriado em gelo antes da injeção da
amostra no sequenciador.
Ambas as fitas de polinucleotídeos de
DNA foram sequenciados utilizando
iniciadores senso e reverso. Os resultados
desta análise (sequência de pares de base
dos DNA’s) foram comparados com as
sequências existentes no banco de dados de
DNA, utilizando o algoritmo BLAST
(ALTSCHUL et al., 1990), para confirmação
da espécie de microrganismo.
3.9 Amplificação do gene rumA
(codificador da produção de bacteriocina)
A amplificação do gene rumA se
processou mediante a “construção” de primers
específicos tomando por base trabalhos com
R. gnavus anteriormente publicados, com
mecanismos de dependência de tripsina para
a produção de substância antagonista muito
semelhante ao encontrado em nosso trabalho
(DABARD et al., 2001; GOMEZ et al., 2002a e
2002b; MARCILLE et al., 2002)
3.10 Reação em Cadeia da Polimerase
para Amplificar o gene rumA
O DNA total obtido de R. gnavus foi
diluído, de acordo com a quantidade
visualizada, e utilizado no seguinte protocolo
de PCR:
Os iniciadores (primers) utilizados para
amplificar a região codificadora de rumA foram
solicitados à DIALAB Diagnósticos (Belo
Horizonte, Minas Gerais, Brasil) e fabricados
pela Integrated DNA Technologies, Inc.
(Coralville, USA).
Primer rumI (Forward)
5’- TTG CGG ATT GAC AGG CAT TTA TGC
G-3’
Primer rumII (Reverse)
5’- GCA GCA CAT TCT AGA AAA CAG TCA
G-3’ Xba I – tctaga
Sequência traduzida do gene RumA
2742 pb (ATG inicial sem stop codon TAA).
Tamanho esperado para amplificação
parcial do gene rumA de Ruminococcus
gnavus, utilizando os primers rumI (Forward)
e rumII (Reverse) = 951 pb
O programa utilizado no termocilador
foi o seguinte:
Após o término da reação de PCR, 5 L
do tampão da amostra foram colocados nos
tubos contendo os produtos. Os DNA’s
corados foram, então, submetidos à
eletroforese (submersão) em gel de agarose

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1,0 %, sendo 12 L por canaleta. A corrida foi
realizada utilizando-se 80 V e 100 A, durante
uma hora. Depois de terminada a eletroforese,
os géis foram levados ao aparelho de
fotodocumentação para visualização dos
resultados.
3.11 Purificação dos Produtos de PCR
rumA
Os produtos de PCR rumA foram
purificados com a utilização do kit
“GENECLEAN II” (Qbiogene, Inc., Morgan
Irvine, USA), como citado anteriormente, no
item 4.10.1.6. Os DNA’s obtidos foram
diluídos e submetidos à eletroforese em gel de
agarose (1%), sob as mesmas condições
citadas anteriormente. Após a corrida, os géis
foram visualizados através do aparelho de
fotodocumentação.
3.12 Sequenciamento do gene rumA de
Ruminococcus gnavus
Para a realização do sequenciamento
do gene rumA (codificador da produção de
bacteriocina), as bandas amplificadas dos
géis de agarose, após a reação de PCR foram
cortadas, e foi utilizado um kit específico
(GENECLEAN II) para a purificação do DNA.
O DNA purificado foi reamplificado para
realização da reação de sequenciamento, em
um equipamento ABI 3100 - MegaBACETM
DNA Analysis Systems (Amersham
Biosciences, USA). Após a reamplificação do
DNA, foi preparado um mix conforme quadro
abaixo (quantidade suficiente para uma
reação):
Para o preparo das amostras de DNA
para o sequenciamento, foi distribuído 9 L do
mix para cada tubo. Adicionou-se 1 L de DNA
e o tubo colocado em uma máquina
termocicladora MJ Research, sendo utilizado
o seguinte programa:
Duração 30 ciclos
96 °C 20 segundos
50 °C 10 segundos
60 °C 4 minutos
Logo após, procedeu-se o processo de
precipitação, adicionando 40 L de
isopropanol 75%. O material foi mantido a
temperatura ambiente por 15 minutos e
centrifugado passado este período, a 15.350
g, por 20 minutos a 20 °C. Fez-se o descarte
do sobrenadante e adicionou 100 µL de etanol
70% (Merck). Novamente, a amostra foi
centrifugada, porém por 10 minutos, a 15.350
g, a 20 °C. O sobrenadante foi descartado e
seco a temperatura ambiente protegida da luz.
Depois da secagem, o material foi suspenso
em 10 µL de formamida Hi-Di. O DNA, pôde
ser então, desnaturado a 95 °C por 5 minutos
e resfriado em gelo antes da injeção da
amostra no sequenciador.
Ambas as fitas de polinucleotídeos de
DNA foram sequenciados utilizando
iniciadores senso e reverso. Os resultados
desta análise (sequência de pares de base
dos DNA’s) foram comparados com as
sequências existentes no banco de dados de
DNA, utilizando o algoritmo BLAST
(ALTSCHUL et al., 1990), para confirmação
do gene procurado.
3.13 Extração do DNA plasmidial
O DNA plasmidial foi extraído
baseando-se em técnica empregada para a
extração de plasmídeos de outras bactérias
Gram-positivo (enterococos e Staphylococcus
aureus), descrita por VRIESEMA et al., em
1996. As culturas de R. gnavus, E. lentum e B.
vulgatus foram crescidas em 500 mL de caldo
BHI-S, sob anaerobiose a 37ºC, durante 24
horas. Então, os tubos foram retirados da
estufa, os caldos com os cultivos transferidos
para tubos de 175 mL que foram centrifugados
a 1.970 g, a 4ºC, durante 15 minutos. Os
sobrenadantes foram descartados e os pellets
suspensos com 150 mL de água deionizada,
utilizando o vórtex. Os tubos foram novamente
centrifugados a 1.970 g, a 4ºC, durante 15
minutos. Os sobrenadantes foram
descartados e os pellets foram suspensos

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com 50 mL de cloreto de lítio (1 M), sendo os
tubos incubados durante 30 minutos, sob
agitação. Os tubos foram novamente
centrifugados a 1.970 g, a 4ºC, durante 15
minutos. Os pellets foram suspensos com 10
mL de solução de cloreto de lítio (5 M) e foram
incubados durante uma hora, sob agitação.
Os tubos foram novamente centrifugados a
1.970 g, a 4ºC, durante 15 minutos. Os pellets
foram lavados e suspensos com 50 mL água
deionizada. Então, os tubos foram
centrifugados a 1.970 g, a 4ºC, durante 15
minutos. Em seguida, foram adicionados aos
pellets 2 mL de solução P1 (100 mM Tris-HCl
– pH 7,5; 10 mM EDTA), adicionada de 10 L
de RNase, suspendendo-os, e deixou-se em
repouso, a temperatura ambiente por 5
minutos. Depois, foram adicionados 6 mL de
solução de lise (água deionizada, dodecil
sulfato de sódio a 20% e hidróxido de sódio 3
N) e deixou-se em repouso a temperatura
ambiente por 5 minutos. Em seguida, 4,5 mL
de acetato de potássio foram adicionados e os
tubos foram mantidos, imersos em gelo,
durante 15 minutos. O material foi
centrifugado a 1.970 g, a 4ºC, durante 30
minutos. Os sobrenadantes foram transferidos
para outros tubos, onde havia 7 mL de
fenol:clorofórmio (1:1), sendo mantidos sob
agitação à temperatura ambiente, durante 5
minutos. Os tubos foram centrifugados a
1.970 g, a 4ºC, durante 10 minutos. Então as
etapas anteriores, desde a transferência dos
sobrenadantes para outros tubos, foram
repetidas duas vezes. Sete mililitros de
clorofórmio foram adicionados aos
sobrenadantes, mantendo-se os tubos sob
agitação durante 5 minutos. Os tubos foram
centrifugados a 1.970 g, a 4ºC, durante 10
minutos. Em seguida, sobrenadantes foram
transferidos para outros tubos, onde havia 7
mL de isopropanol com a finalidade de
precipitar os DNA’s. Os tubos foram
centrifugados a 1.970 g, a 4ºC, durante 40
minutos. Os sobrenadantes foram
cuidadosamente retirados e os pellets lavados
com a adição de 5 mL de etanol (70%), para
facilitar a evaporação de todo o álcool. Depois,
os tubos foram centrifugados a 1.970 g, a 4ºC,
durante 10 minutos e o álcool foi
cuidadosamente retirado. Após os pellets
secarem, 100 L de solução TE (pH 8,0) ou
água deionizada foram utilizados para
suspendê-los.
Após a extração, 10 L de cada DNA
plasmidial foram misturados com 2 L de
tampão glicerol adicionado de azul de
bromotimol (uma parte para cada cinco partes
da amostra). Os DNA’s corados foram, então,
submetidos à eletroforese (submersão) em gel
de agarose 1% (0,5 grama de agarose diluída
em 50 mL de TE 1x, acrescida, depois de
aquecida em forno micro-ondas, de 5 L de
brometo de etídeo). A corrida foi realizada
utilizando-se 70 V e 100 A, durante uma hora.
Depois de terminada a eletroforese, os géis
foram levados ao aparelho de
fotodocumentação para visualização dos
resultados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nosso trabalho, em um primeiro
momento, se propôs a estudar as condições
de produção de substância antagonista de um
Peptostreptococcus sp., o qual foi isolado da
microbiota do trato gastrintestinal de um ser
humano adulto saudável, por NICOLI &
RAIBAUD nos anos 90. Verificou-se, naquela
época, que este microrganismo tinha a
capacidade de produzir in vivo e ex vivo
substância antagonista contra espécies não
relacionadas, destacando-se a inibição de
Clostridium perfringens, responsável por
quadros de intoxicação.
Diante deste fato, em 1993, RAMARE
et al., demonstraram em testes de
antagonismo in vitro e in vivo, que este
microrganismo (até então, um
Peptostreptococcus sp.), não é capaz de inibir
o crescimento de C. perfringens, na ausência
da tripsina secretada pelo hospedeiro. Este
acontecimento serviu para chamar a atenção
para a pesquisa da produção de substância
antagonista sob diferentes aspectos e
condições, demonstrando ser necessária a
caracterização da produção de substância
antagonista no trato digestivo de mamíferos
para se poder pensar em utilizá-la como
método de eliminação de patógenos e
tratamento de infecções entéricas.

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9
Além disso, este acontecimento era o
primeiro relato científico de uma possível
“colaboração” ou dependência de fatores do
hospedeiro vinculada à produção de
substância antagonista, senão para todos,
pelo menos para o gênero
Peptostreptococcus.
Embora as substâncias antagonistas,
principalmente as bacteriocinas, sejam
extensivamente pesquisadas, parece não
existir até o momento, uma elucidação
completa a respeito do tema. Além disso, a
produção dessas substâncias antagonistas é
geralmente demonstrada e estudada in vitro,
ficando a dúvida da sua produção e papel in
vivo, sob condições das mais variadas
possíveis, no ecossistema digestivo.
Este microrganismo havia sido
identificado fenotipicamente por meio de
provas bioquímicas como sendo um
Peptostreptococcus sp.; e foi submetido por
nós, neste estudo, a uma análise da
sequência de rDNA 16S, e posteriormente foi
identificado como R. gnavus. Após extensa
pesquisa bibliográfica pôde-se constatar que
este fenômeno de dependência ou da
necessidade da presença da tripsina
produzida pelo hospedeiro para que a
substância seja ativa, já havia sido descrito
para o gênero Ruminococcus e que alguns
microrganismos deste grupo possuem a
capacidade de produzir substâncias
antagonistas e bacteriocinas, algumas
inclusive já caracterizadas e descritas.
Mediante a esta constatação, este
trabalho procurou avaliar uma linhagem de R.
gnavus quanto às condições de produção de
substância antagonista contra C. perfringens
in vitro, ex vivo e in vivo em camundongos
gnotoxênicos; destacando sua capacidade
protetora e possível potencial probiótico e
caracterizar a substância inibitória produzida
pelo R. gnavus, por meio de bioensaios e
técnicas moleculares específicas.
1. Técnicas de Biologia Molecular
1.1 Caracterização e Identificação
Molecular de Ruminococcus gnavus
O microrganismo deste trabalho foi
isolado da microbiota dominante fecal de um
ser humano saudável, sendo que este
apresentou um potente efeito antagonista
contra C. perfringens em modelo gnotobiótico
(NICOLI & RAIBAUD, 1990), foi identificado
anteriormente (como já citado), por meio de
provas bioquímicas como Peptostreptococcus
sp.. Esta bactéria, após ser submetida à
análise da sequência de rDNA 16S, foi
identificada como Ruminococcus gnavus.
A Figura 1 mostra os fragmentos
gênicos amplificados pelos primers universais
já descritos e que foram submetidos ao
sequenciamento para identificação genotípica
do microrganismo.
As sequências gênicas obtidas após o
sequenciamento do rDNA de R. gnavus foram
comparadas com as sequências existentes no
banco de dados de DNA, utilizando o
algoritmo BLAST (ALTSCHUL et al., 1990),
confirmando a espécie de microrganismo. As
mesmas não se encontram presentes neste
trabalho, pois ainda não foram depositadas no
banco de dados de DNA já que novos
sequenciamentos deverão ser realizados para
a confirmação de sequências inéditas deste
microrganismo.
Figura 1. Foto do gel de agarose mostrando a
amplificação de fragmentos gênicos pelos primers
universais já descritos e que foram submetidos ao
sequenciamento para real identificação do
microrganismo. Canaletas da esquerda para a direita:
1. Marcador de peso molecular 1 Kb; 2. Primers
16SF518-16SR928; 3. Primers 16SF518-16SR1542; 4.
Primers 16SF27-16SR928; 5. Primers 16SF27-
16SR1542; 6. Amplificação do gene rumA (três
bandas); 7. Vazia; 8. Reamplificação da banda de
interesse (maior) do gene rumA após purificação; 9.
Marcador de peso molecular λ.

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1.2 Amplificação do gene rumA
(codificador da produção de bacteriocina)
A amplificação do gene rumA (ver
Figura 2), se processou mediante a
“construção” de primers específicos tomando
por base trabalhos com R. gnavus
anteriormente publicados, com mecanismos
de dependência de tripsina para a produção
de substância antagonista muito semelhante
ao encontrado em nosso trabalho (DABARD
et al., 2001; GOMEZ et al., 2002a e 2002b;
MARCILLE et al., 2002).
Parte (fragmento) do Gene rumA
sequenciado:
GTATCTTGAACAATTAACGACCGAAATATAATT
CAGCCGGATATCACAGAAAAATATATAAGAAAT
ATTGAAGAAGTAATAAGAAATAATATTGTTAAA
ACTAGCAGCTATGATACTTTGGCAGGAATTCAT
TCAGCAGTTATTTATTATTTTGGGTGTTGTAAA
CAAGACGCATTTTCTAGAGAAATTTTATCATCT
ATAGAAGATTATTTTTTAAATAGTTTTAAAATT
GATGATATGAAAAGAAATTTTAATTATGCAAGT
TTTGCACATGGGTATTCAGGAGTTATGACATCA
ATTATGTGTATGCTTCAGCATACATCTGATGTA
AAATTAGAAAAAATTTTATGTGAACTGTGGAAA
GAAGAAAAAAAATTGCATGTTGAAAAATTTATA
TGGAAAGATATGCGAACTCATCATATCGTACAT
TCACATTACTGGTGTCATGGTTCAGTAGGCATT
ATGATGGCAAGATTGATTTGGATAAAATTGGGG
TTTGATAAAAAATTTGCTAAAGATATAGAAGAA
GAAAATTTAATAGAAATATTGTCTATATATAAG
GAAGAACTTCTAAAT
Este experimento, veio a comprovar
que a substância produzida pelo R. gnavus é
uma bacteriocina já descrita e conhecida
como ruminococcin A (RumA). Quando
cultivado na presença de tripsina, R. gnavus
pode produzir uma substância anti-bacteriana
que se acumula no sobrenadante. A
similaridade a outras bacteriocinas atuais em
bibliotecas sugeriu fortemente que essa
substância pertence à classe IIA dos
lantibióticos.
Recentemente, uma região 12.8-kb do
genoma do R. gnavus que contém as
determinantes genéticas para a produção de
RumA foi caracterizada. O conjunto do gene
do rumA é organizado em três operons com
funções preditas na biosíntese e na secreção
do lantibiótico (rumA1A2A3MTX),
regulamento do sinal-transdução (rumRK), e
imunidade própria do produtor (rumFEGHR2).
A transcrição de operons do gene rum
mostrou-se ser induzida na presença da
tripsina, provavelmente através do sistema de
dois componentes RumRK (GOMEZ et al.,
2002a e 2002b).
Essa mesma região (12.8-kb), citada
acima, do cromossomo do R. gnavus, foi
clonada e foi arranjada em sequência.
Consistiu em 13 janelas de leitura aberta,
organizados em três operons. Uma
característica incomum do locus é a presença
de três genes estruturais quase idênticos,
todos que codificam o precursor de RumA. A
fim determinar o papel da tripsina na produção
de RumA, a transcrição dos genes foi
investigada sob circunstâncias de indução e
não-inducão. A atividade da tripsina é
necessária para a ativação fase-dependente
do crescimento transcricional do crescimento
de operons de RumA.
Nossos resultados, assim como
aqueles demonstrados por GOMEZ et al., em
2002a e 2002b, sugerem que a produção da
bacteriocina pelo R. gnavus é controlada
através de um mecanismo complexo
sinalizando que envolve processamento
proteolítico de um peptídeo indutor
extracelular putativo pela tripsina, uma
sugestão ambiental específica do
ecossistema digestivo.
As bactérias habitam os nichos
ecológicos diversos em que a sobrevivência e
a adaptação dependem de sua capacidade de
detectar as circunstâncias ambientais locais e
regular a expressão de genes específicos em
resposta aos estímulos externos. Nas
bactérias Gram-positivo, a maioria das
moléculas extracelulares de sinal
responsáveis por este tipo de comunicação,
são peptídeos produzidos por elas mesmas,
derivados de um precursor maior
processando da região do N-terminal. Tais
sistemas regulatórios peptídeos-dependentes
têm sido mostrados recentemente para
participar da produção de bacteriocina. Um
dos exemplos melhor caracterizados é a
produção da nisina pelo Lactococcus lactis.

11. ISSN 2318-4752 – Volume 9, N2, 2021
11
Além da sua atividade antimicrobiana, a nisina
funciona como o indutor de sua própria
síntese através do sistema da transdução do
sinal de dois componentes do gene nisKR
(DABARD et al., 2001).
No caso específico do R. gnavus, os
resultados precedentes sugeriram que a
tripsina esteve envolvida na indução da
síntese da bacteriocina. A ação da tripsina
pareceu ser específica, desde que a atividade
da bacteriocina não foi detectada quando o R.
gnavus foi cultivado em meio de cultura
suplementado com outras enzimas
proteolíticas digestivas secretadas pelo
pâncreas tais como a quimiotripsina, a
elastase, e as carboxipeptidases A e B,
demonstrado por RAMARE et al., em 1993.
Por causa de sua produção por uma
bactéria intestinal e de sua atividade de
encontro aos clostridia enteropatogênicos,
RumA pode ser do interesse particular na
alimentação animal e na saúde humana.
Figura 2. Foto do gel de agarose mostrando a
amplificação do gene rumA pelos primers específicos já
descritos e que foram submetidos ao sequenciamento.
Canaletas da esquerda para a direita: 1. Marcador de
peso molecular 1 Kb; 2. Amplificação do gene rumA
(três bandas); 3. Vazia; 4. Reamplificação da banda de
interesse (maior – circulada) do gene rumA após
purificação; 5. Marcador de peso molecular λ.
1.3 Extração do DNA plasmidial
O DNA plasmidial foi extraído
baseando-se em técnica empregada para a
extração de plasmídeos de outras bactérias
Gram-positivo (enterococos e Staphylococcus
aureus), descrita por VRIESEMA et al., em
1996. As culturas de R. gnavus, Eubacterium
lentum e Bacteroides vulgatus foram
crescidas em 500 mL de caldo BHI-S, sob
anaerobiose a 37ºC, durante 24 horas.
Não foram encontrados genes
plasmidiais nestes microrganismos (R.
gnavus, Eubacterium lentum e Bacteroides
vulgatus), como mostra a foto do gel (Figura
3), o que torna pouco provável a possibilidade
de transformação por simples transferência de
genes no ambiente do trato gastrintestinal.
Embora o DNA cromossômico possa ser
facilmente transferido para a bactéria
receptora competente, o DNA plasmidial não
o é facilmente transferidos por processos de
transformação comum, que simplesmente
adicionam DNA às células receptoras.
Este experimento nos fez afirmar com
segurança sobre a impossibilidade de uma
conjugação entre os microrganismos no que
diz respeito, principalmente aos plasmídios
bacteriocinogênicos. Estes plasmídios contêm
um gene que capacita a célula hospedeira a
sintetizar uma bacteriocina. No caso do R.
gnavus, o mesmo não apresentou plasmídios
e o gene codificador da produção de sua
bacteriocina foi encontrado no DNA
cromossomal.
Figura 3. Foto do gel de agarose mostrando a ausência
de plasmídeos em Ruminococcus gnavus, Eubacterium
lentum e Bacteroides vulgatus. Canaletas da esquerda
para a direita: 1. Marcador de peso molecular 1 Kb; 2.
R. gnavus; 3. E. lentum antes da associação em animal
juntamente com R. gnavus; 4. E. lentum pós-
associação em animal juntamente com R. gnavus; 5. B.
vulgatus antes da associação em animal juntamente
com R. gnavus; 6. B. vulgatus pós-associação em
animal juntamente com R. gnavus.

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12
CONCLUSÕES
Pelos resultados obtidos e nas
condições em que foram realizados os testes,
realizou-se a avaliação de uma linhagem de
Ruminococcus gnavus quanto às condições
de produção de substância antagonista.
Pôde-se constatar que:
- A substância inibitória produzida pelo
R. gnavus é muito semelhante a uma
bacteriocina já descrita e conhecida como
ruminococcin A (RumA). O gene não é
plasmidial. A similaridade a outras
bacteriocinas atuais em bibliotecas sugeriu
fortemente que essa substância pertence à
classe IIA dos lantibióticos.
- Uma conjugação entre o R. gnavus e
outros microrganismos no que diz respeito,
principalmente aos plasmídios
bacteriocinogênicos é praticamente
descartada, já que o mesmo não apresentou
plasmídios e o gene codificador da produção
de sua bacteriocina foi encontrado no DNA
cromossomal. A possibilidade de transmissão
in vivo da capacidade de produção da
substância inibitória para bactérias Gram-
positivo e Gram-negativo inicialmente não
produtoras, em animais gnotoxênicos não foi
observada confirmando este fato.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALTSCHUL, S.F.; GISH, W.; MILLER, W.;
MYERS, E.W.; LIPMAN, D.J. Basic local
alignment search tool. J. Mol. Biol., v. 215, p.
403-410, 1990.
BARRY, T.; COLLERAN, G.; GLENNON, M;
DUNICAN, L.K.; GANNON, F. The 16S/23S
ribosomal spacer region as a target for DNA
probes to identify eubacteria. PCR Method.
Appl., v. 1, p. 51-56, 1991.
BEAUD, D.; TAILLIEZ, P.; ANBA-
MONDOLONI, J. Genetic characterization of
the beta-glucuronidase enzyme from a human
intestinal bacterium, Ruminococcus gnavus.
Microbiology, v. 151, p. 2323-2330, 2005.
DABARD, J.; BRIDONNEAU, C.; PHILLIPE,
C.; ANGLADE, P.; MOLLE, D.; NARDI, M.;
LADIRE, M.; GIRARDIN, H.; MARCILLE, F.;
GOMEZ, A.; FONS, M. Ruminococcin A, a
new lantibiotic produced by a Ruminococcus
gnavus strain isolated from human feces.
Appl. Environ. Microbiol., v. 67, p. 4111-4118,
2001.
GOMEZ, A.; LADIRE, M.; MARCILLE, F.;
FONS, M. Trypsin mediates growth phase-
dependent transcriptional regulation of genes
involved in biosynthesis of ruminococcin A, a
lantibiotic produced by a Ruminococcus
gnavus strain from a human intestinal
microbiota. J. Bacteriol., v. 184, p. 18-28,
2002a.
GOMEZ, A.; LADIRE, M.; MARCILLE, F.;
NARDI, M.; FONS, M. Characterization of
ISRgn1, a novel insertion sequence of the IS3
family isolated from a bacteriocin-negative
mutant of Ruminococcus gnavus E1. Appl.
Environ. Microbiol., v. 68, p. 4136-4139,
2002b.
HOLDMAN, L.V.; CATO, E.P.; MOORE,
W.E.C. Anaerobe Laboratory Manual. The
Virginia Polytechnic Institute and State.
University Anaerobe Laboratory, p. 156, 1977.
KRAUSE, M.; BEAUCHEMIN, K.A.; RODE,
L.M.; FARR, B.I.; NORGAARD, P. Fibrolytic
enzyme treatment of barley grain and source
of forage in high-grain diets fed to growing
cattle. J. Anim. Sci., v. 76, p. 2912-2920, 1998.
MARCILLE, F.; GOMEZ, A.; JOUBERT, P.;
LADIRE, M.; VEAU, G.; CLARA, A.; GAVINI,
F.; WILLEMS, A.; FONS, M. Distribution of
genes encoding the trypsin-dependent
lantibiotic ruminococcin A among bacteria
isolated from human fecal microbiota. Appl.
Environ. Microbiol., v. 68, p. 3424-3431, 2002.
MURDOCH, D.A. Gram-positive anaerobic
cocci. Clin. Microbiol. Rev., v. 11, p. 81-120,
1998.
NICOLI, J.R.; RAIBAUD, P. In vivo and in vitro
antagonistic effect against Clostridium

13. ISSN 2318-4752 – Volume 9, N2, 2021
13
perfringens of a diffusible compound produced
by a Peptostreptococcus sp from human
intestinal flora in mice. Microecol. Therap., v.
20, p. 141-146, 1990.
RAMARE, F.; NICOLI, J.; DABARD, J.;
CORRING, T.; LADIRE, M.; GUEUGNEAU,
A.; RAIBAUD, P. Trypsin-dependent
production of an antibacterial substance by a
human Peptostreptococcus strain in
gnotobiotic rats and in vitro. Appl. Environ.
Microbiol., v. 59, n. 9, p. 2876-2883, 1993.
TANNOCK, G.W.; TILSALA-TIMISJARVI, A.;
RODTONG, S.; NG, J.; MUNRO, K;
ALATOSSAVA, T. Identification of
Lactobacillus isolates from the gastrointestinal
tract, silage, and yoghurt by 16S-23S rRNA
gene intergenic spacer region sequence
comparisons. Appl. Environ. Microbiol., v. 65,
p. 4264-4267, 1999.
VRIESEMA, A.J.; ZAAT, S.A.; DANKERT, J. A
simple procedure for isolation of cloning
vectors and endogenous plasmids from
viridans group streptococci and
Staphylococcus aureus. Appl. Environ.
Microbiol., v. 62, p. 3527-3529, 1996.
____________________________________
1 - Graduação em Ciências Biológicas.
Professor Adjunto do Departamento de
Morfologia (DMO – CCBS) da Universidade
Federal de Sergipe - UFS, Brasil.
E-mail: flaviobarbosaufs@gmail.com
2 - Graduação em Fisioterapia. Mestrado em
Microbiogia. Departamento de Microbiologia
(ICB) da Universidade Federal de Minas
Gerais - UFMG, Brasil.
3 - Graduação em Medicina Veterinária.
Departamento de Microbiologia (ICB) da
Universidade Federal de Minas Gerais -
UFMG, Brasil.
4 - Graduação em Enfermagem. Professor
Adjunto do Curso de Enfermagem da
Universidade Federal do Amapá (UNIFAP),
Brasil.